【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因檢測，尤其涉及檢測人類免疫缺陷病毒1型的捕獲探針、試劑盒和方法。
技術(shù)介紹
1、人類免疫缺陷病毒1型，即hiv-1，是導(dǎo)致艾滋病的病原體。自上世紀80年代初艾滋病首次被識別以來，全球范圍內(nèi)對hiv-1的研究不斷深入。隨著分子生物學(xué)和基因測序技術(shù)的飛速發(fā)展，hiv-1病毒全基因組測序成為揭示病毒特性、進化規(guī)律以及抗病毒藥物研發(fā)的重要手段。hiv-1基因組全長約為9.7kb，包含多個基因區(qū)域，每個區(qū)域都對病毒的復(fù)制、傳播和致病性具有關(guān)鍵作用。因此，對hiv-1病毒全基因組進行測序，有助于全面了解病毒的基因組結(jié)構(gòu)、變異特點以及與其他病原體的相互作用。
2、精準(zhǔn)診斷：hiv-1病毒全基因組測序能夠提供詳細的病毒基因信息，有助于精準(zhǔn)診斷感染者的病毒亞型、感染階段以及病毒載量。這對于制定個性化的治療方案和評估疾病進展具有重要意義。
3、耐藥性監(jiān)測：通過對hiv-1病毒全基因組的測序，可以檢測到特定基因特定位點的突變，與耐藥性有關(guān)，從而可以監(jiān)測抗病毒藥物耐藥性的產(chǎn)生和演變。這有助于及時調(diào)整治療方案，避免耐藥性的進一步發(fā)展，從而提高抗病毒治療的效果。
4、疫苗研發(fā)：hiv-1病毒全基因組測序有助于揭示病毒的免疫逃逸機制和宿主免疫反應(yīng)。這為開發(fā)針對hiv-1的有效疫苗提供了重要的理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。
5、流行病學(xué)研究：通過對不同地域、不同人群中的hiv-1病毒全基因組進行測序和比較，可以了解病毒的傳播路徑、流行特點以及與其他病原體的關(guān)聯(lián)。這對于制定針對性的防控策略和預(yù)防控制措施具有
6、病毒載量：通過對基因組的定量分析，測定基因的拷貝數(shù)，可以監(jiān)測病毒載量的變化，從而評估治療效果或病毒復(fù)制的動態(tài)。
7、常規(guī)的全基因組測序數(shù)據(jù)量大，成本高。hiv-1的待測樣本來源于人體，若直接測序，實際99.9％以上都是人的基因序列，數(shù)據(jù)有大量的冗余，且由于人體基因占有多數(shù)，低病毒載量的樣本難以檢出。
8、雜交捕獲技術(shù)(hybrid?capture?technology,hct)是一種分子生物學(xué)方法，它通過使用特定設(shè)計的互補探針與樣本中的靶序列進行特異性雜交，形成穩(wěn)定的雜交雙鏈；然后利用物理或化學(xué)手段捕獲這些雜交體，并通過清洗去除未結(jié)合的探針和非特異性結(jié)合物，從而富集目標(biāo)序列，最后對捕獲的序列進行檢測和分析，實現(xiàn)對特定dna或rna序列的高特異性和高靈敏度的檢測。相對于其他pcr方法進行基因組測序，使用雜交捕獲技術(shù)特異性、靈敏度、覆蓋度、均一性等都更高。
9、因此，有必要研發(fā)hiv-1全基因組的捕獲探針，解決常規(guī)全基因組測序中大量人體基因冗余問題，提高檢測效率，降低檢測成本，進一步降低檢測限，能夠檢測低載量樣本的耐藥突變、低頻突變以及病毒載量。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是，提供一種檢測人類免疫缺陷病毒1型的捕獲探針，可對hiv-1進行全基因組測序，覆蓋區(qū)域廣，可同時檢測病載和耐藥突變，降低檢測成本，擴大應(yīng)用范圍。
2、本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案是：
3、一種檢測人類免疫缺陷病毒1型的捕獲探針，所述捕獲探針按以下方法設(shè)計得到：
4、根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫中hiv的標(biāo)準(zhǔn)毒株以及亞型毒株的多條參考基因組全基因序列，采用疊瓦式設(shè)計得到多條捕獲探針，構(gòu)建總rna文庫后捕獲探針捕獲hiv全基因組文庫，探針序列密集的重復(fù)覆蓋每條參考基因組的全部區(qū)域，探針設(shè)計參數(shù)為：長度120nt，疊瓦頻率為3x～6x?tiling；
5、疊瓦式設(shè)計是指，將多個探針按照一定的重疊度排列，以覆蓋目標(biāo)區(qū)域的整個序列。疊瓦頻率為3x、4x、5x或6x，含義是捕獲探針在疊瓦每個片段時都重疊33％、25％或20％，即每個堿基被三個探針、四個探針或五個探針?biāo)采w。
6、優(yōu)選疊瓦頻率為5x?tiling。
7、進一步，捕獲探針的gc含量在20-80％之間。
8、進一步，捕獲探針對hiv的基因組序列具有特異性。
9、可采用生物信息學(xué)軟件設(shè)計捕獲探針文庫。
10、捕獲探針的制備方法也是公知的，將設(shè)計的捕獲探針的序列通過商業(yè)化探針合成公司進行合成并制備捕獲探針，具體操作為：先使用高通量dna合成平臺合成探針dna模板，適度pcr放大并純化后進行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄的過程中是序列3’端或5’端帶有生物素修飾，制得rna探針。
11、所述多條參考基因組全基因序列，可以為下列參考基因組全基因序列中的2種以上，優(yōu)選為下列全部參考基因組全基因序列：
12、et-368370.1
13、gv564221.1
14、k03455.1
15、kc914396.1
16、mw110767.1
17、u52953.1。
18、作為優(yōu)選，所述捕獲探針包括seq?id?no?1～1891所示序列。
19、本專利技術(shù)的捕獲探針以hxb2標(biāo)準(zhǔn)毒株作為參考毒株設(shè)計探針，覆蓋hxb2毒株基因組全長；另外覆蓋了多種亞型的參考基因組序列。
20、本專利技術(shù)還提供檢測人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒，包括所述捕獲探針。
21、所述試劑盒還可以包括核酸提取試劑、rna反轉(zhuǎn)錄試劑，文庫構(gòu)建試劑、雜交捕獲試劑等，可采用相應(yīng)的市售商品試劑盒。如dna&rna共提取試劑可使用賽默飛、全式金、諾唯贊、天根等廠家試劑。文庫構(gòu)建試劑可使用因美納、全式金、諾唯贊、天根等廠家試劑。雜交捕獲試劑可使用羅氏、納昂達、twist、迪贏等廠家試劑。實驗流程根據(jù)使用廠家試劑不同而不同，使用的試劑需根據(jù)廠家試劑說明書使用，試劑廠家選擇包含不限于所列舉廠家。
22、本專利技術(shù)還提供檢測人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒在檢測hiv-1病毒基因中的應(yīng)用。進一步，所述應(yīng)用為，利用人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒對待測樣本中的hiv-1病毒基因進行全基因測序，根據(jù)測序結(jié)果進行分析，鑒定病毒分型、檢測病毒載量和耐藥突變。
23、本專利技術(shù)還提供利用所述試劑盒檢測hiv-1病毒基因的方法，所述方法包括以下步驟：
24、(1)提取待測樣品核酸；
25、(2)構(gòu)建文庫；
26、構(gòu)建文庫一般包括rna片段化、反轉(zhuǎn)錄成cdna、末端修復(fù)、加a尾，接頭連接，擴增文庫，最后純化，構(gòu)建得到文庫；
27、(3)使用檢測人類免疫缺陷病毒1型的捕獲探針進行雜交捕獲、pcr擴增，得到雜交捕獲后的文庫；
28、(4)雜交捕獲后的文庫進行全基因測序，測序數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)的耐藥分析、基因分型分析、病毒載量分析，得到病毒基因的基因分型、耐藥突變和病毒載量。
29、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)技術(shù)方案具有如下有益效果：
30、本專利技術(shù)通過捕獲探針捕獲樣本中的hiv-1基因序列，獲得hiv-1的近乎全長的基因組序列信息，優(yōu)化了測序數(shù)據(jù)，減少了無效數(shù)據(jù)冗余，提高測序效率，降低測序成本。...
【技術(shù)保護點】
1.一種檢測人類免疫缺陷病毒1型的捕獲探針，其特征在于所述捕獲探針按以下方法設(shè)計得到：
2.如權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其特征在于每條捕獲探針的GC含量在20-80％之間。
3.如權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其特征在于捕獲探針對HIV的基因組序列具有特異性。
4.如權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其特征在于所述多條參考基因組全基因序列為下列參考基因組全基因序列中的2種以上：
5.如權(quán)利要求4所述的捕獲探針，其特征在于所述多條參考基因組全基因序列為ET-368370.1、GV564221.1、K03455.1、KC914396.1、MW110767.1和U52953.1。
6.如權(quán)利要求5所述的捕獲探針，其特征在于，所述捕獲探針包括SEQ?ID?NO?1～1891所示序列。
7.如權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其特征在于，疊瓦頻率為5X?Tiling。
8.人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒，包括權(quán)利要求1～7任一項所述的捕獲探針。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括核酸提取試劑、
10.如權(quán)利要求7或8所述的人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒在檢測HIV-1病毒基因中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為，利用人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒對待測樣本中的HIV-1病毒基因進行全基因測序，根據(jù)測序結(jié)果進行分析，鑒定病毒分型、檢測病毒載量和耐藥突變。
12.利用如權(quán)利要求8或9所述的人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒所述試劑盒檢測HIV-1病毒基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測人類免疫缺陷病毒1型的捕獲探針，其特征在于所述捕獲探針按以下方法設(shè)計得到：
2.如權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其特征在于每條捕獲探針的gc含量在20-80％之間。
3.如權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其特征在于捕獲探針對hiv的基因組序列具有特異性。
4.如權(quán)利要求1所述的捕獲探針，其特征在于所述多條參考基因組全基因序列為下列參考基因組全基因序列中的2種以上：
5.如權(quán)利要求4所述的捕獲探針，其特征在于所述多條參考基因組全基因序列為et-368370.1、gv564221.1、k03455.1、kc914396.1、mw110767.1和u52953.1。
6.如權(quán)利要求5所述的捕獲探針，其特征在于，所述捕獲探針包括seq?id?no?1～1891所示序列。
7.如...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：高俊莉，高俊順，陳勝，李相辰，章燕，
申請(專利權(quán))人：杭州廣科醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。