【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于細(xì)胞培養(yǎng)，具體涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測方法及檢測試劑。
技術(shù)介紹
1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells，mscs)，是一種具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在特定的條件下可以誘導(dǎo)分化為脂肪、骨和軟骨等多種組織。干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，通常是體外進(jìn)行培養(yǎng)研究，由于干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的復(fù)雜性，體外定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基相對于傳統(tǒng)普通細(xì)胞培養(yǎng)基要昂貴得多。
2、間充質(zhì)干細(xì)胞在成軟骨分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)中，培養(yǎng)周期較長，而且染色鑒定結(jié)果為定性分析，且易受不同操作人員和不同批次染料的影響導(dǎo)致結(jié)論差異巨大，這無疑大大提高了間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成本。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)的目的在于提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測試劑，以ii型膠原蛋白基因(collagen?ii)為檢測對象，利用qpcr在誘導(dǎo)培養(yǎng)7～14天時即可完成間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化潛力的檢測，而且檢測結(jié)果準(zhǔn)確快速。
2、本專利技術(shù)提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測試劑，包括ii型膠原蛋白基因qpcr檢測引物；
3、所述ii型膠原蛋白基因qpcr檢測引物包括核苷酸序列如seq?id?no:1所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no:2所示的反向引物。
4、本專利技術(shù)提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測試劑盒，包括所述檢測試劑、內(nèi)參基因引物和qpcr檢測預(yù)混液。
5、優(yōu)選
6、本專利技術(shù)提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測方法，包括以下步驟：
7、將間充質(zhì)干細(xì)胞接種于成軟骨分化培養(yǎng)基中進(jìn)行成脂分化培養(yǎng)，培養(yǎng)至第7～14d時，收集分化細(xì)胞，提取總rna，反轉(zhuǎn)錄，得到cdna，記為分化組cdna；
8、以與分化組同批次的間充質(zhì)干細(xì)胞直接提取總rna，反轉(zhuǎn)錄，得到cdna，記為對照組cdna；
9、分別以分化組cdna和對照組cdna為模板，利用所述檢測制劑中ii型膠原蛋白基因引物進(jìn)行qpcr檢測，根據(jù)計(jì)算的ii型膠原蛋白基因的相對表達(dá)量判斷間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力：
10、當(dāng)ii型膠原蛋白基因的相對表達(dá)量≥2時，所述間充質(zhì)干細(xì)胞具有成軟骨潛力，且相對表達(dá)量與成軟骨潛力呈正比；
11、當(dāng)ii型膠原蛋白基因的相對表達(dá)量＜2時，所述間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力較低。
12、優(yōu)選的，所述ii型膠原蛋白基因的相對表達(dá)量的計(jì)算公式見公式i:
13、分化mrna相對表達(dá)量＝2-{(分化組collageniict均值-分化組內(nèi)參基因ct均值)-(對照組collageniict均值-對照組內(nèi)參基因ct均值)}公式i；
14、優(yōu)選的，分化組中，待所述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為60％～70％時進(jìn)行成軟骨分化培養(yǎng)；
15、所述成軟骨分化培養(yǎng)時，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的接種量為1.0×105～10×105個細(xì)胞/孔。
16、優(yōu)選的，所述成軟骨分化培養(yǎng)基為含質(zhì)量百分含量9.5％～10.5％成軟骨分化因子添加物的成軟骨分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
17、優(yōu)選的，所述成軟骨分化培養(yǎng)中，每3～4天更換一次成軟骨分化培養(yǎng)基。
18、優(yōu)選的，所述qpcr檢測的反應(yīng)體系為10μl，具體包括以下含量的試劑：2×tsingke*masterqpcrmix-sybr(+udg)5.0μl、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl和cdna4.0μl；
19、所述qpcr檢測的反應(yīng)程序?yàn)?0℃×2min；95℃×2min；95℃×15sec，55℃×30sec，72℃×30sec，循環(huán)45次；單點(diǎn)熒光檢測的溫度為72℃。
20、優(yōu)選的，所述間充質(zhì)干細(xì)胞包括臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和/或羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
21、本專利技術(shù)提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測試劑，包括ii型膠原蛋白基因qpcr檢測引物，核苷酸序列如seq?id?no:1～seq?id?no:2所示。本專利技術(shù)開發(fā)的檢測試劑是基于ii型膠原蛋白基因的相對表達(dá)量在間充質(zhì)干細(xì)胞和成軟骨分化細(xì)胞中差異性表達(dá)實(shí)現(xiàn)檢測目的。基于qpcr檢測技術(shù)利用開發(fā)的檢測試劑可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、定量成軟骨潛力的檢測目的，解決了現(xiàn)有技術(shù)需要經(jīng)驗(yàn)判定的非客觀因素的影響，而且在誘導(dǎo)培養(yǎng)7～14天時即可檢測，大大縮短培養(yǎng)時間，降低了培養(yǎng)成本。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測試劑，其特征在于，包括II型膠原蛋白基因qPCR檢測引物；
2.一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述檢測試劑、內(nèi)參基因引物和qPCR檢測預(yù)混液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測試劑盒，其特征在于，所述qPCR檢測預(yù)混液包括2×TsingKe*MasterqPCRMix-SYBR(+UDG)。
4.一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測方法，其特征在于，所述II型膠原蛋白基因的相對表達(dá)量的計(jì)算公式見公式I:
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測方法，其特征在于，分化組中，待所述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為60％～70％時進(jìn)行成軟骨分化培養(yǎng)；
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測方法，其特征在于，所述成軟骨分化培養(yǎng)基為含質(zhì)量百分含量9.5％～10.5％成軟骨分化因子添加物的成軟骨分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述檢測方法，其特征在于，所述成軟骨分化培養(yǎng)中，
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測方法，其特征在于，所述qPCR檢測的反應(yīng)體系為10μL，具體包括以下含量的試劑：2×TsingKe*Master?qPCR?Mix-SYBR(+UDG)5.0μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL和cDNA4.0μL；
10.根據(jù)權(quán)利要求4～9中任意一項(xiàng)所述檢測方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞包括臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和/或羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測試劑，其特征在于，包括ii型膠原蛋白基因qpcr檢測引物；
2.一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述檢測試劑、內(nèi)參基因引物和qpcr檢測預(yù)混液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測試劑盒，其特征在于，所述qpcr檢測預(yù)混液包括2×tsingke*masterqpcrmix-sybr(+udg)。
4.一種間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛力的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測方法，其特征在于，所述ii型膠原蛋白基因的相對表達(dá)量的計(jì)算公式見公式i:
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測方法，其特征在于，分化組中，待所述間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為60％～...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊文琦，蔣雨薇，李青青，華江舟，
申請(專利權(quán))人：長沙干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)工業(yè)技術(shù)研究院有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。