【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物，具體涉及一種p21-cdk2/cyclin界面抑制劑的篩選方法。
技術(shù)介紹
1、細(xì)胞衰老是一種穩(wěn)定和終末的生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，盡管有最佳的生長(zhǎng)條件和促有絲分裂刺激，細(xì)胞仍無(wú)法增殖。細(xì)胞衰老可以由多種因素引起，包括電離輻射、氧化應(yīng)激、癌基因活化等。目前，衰老機(jī)制主要通過(guò)腫瘤蛋白53(tumor?protein?p53,p53)/細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制蛋白1a(cyclin?dependent?kinase?inhibitor?1a,p21)和/或細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制蛋白2a(cyclin?dependent?kinase?inhibitor?2a,p16)/視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma,rb)兩條途徑完成。細(xì)胞經(jīng)輻射后，p53/p21通路被明顯活化導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老；p16/rb通路則在輻射損傷后期活化從而維持細(xì)胞衰老。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent?kinase,cdk)/細(xì)胞周期蛋白(cyclin)系列復(fù)合物是調(diào)控細(xì)胞周期和有絲分裂的關(guān)鍵蛋白復(fù)合物。p21蛋白是cdk抑制蛋白，它在細(xì)胞周期的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。p21蛋白能夠與多種cdk蛋白形成復(fù)合物，從而抑制cdk的活性，導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯。輻射損傷后，p21的表達(dá)上調(diào)進(jìn)而持續(xù)抑制cdk2/cyclin?a、cdk2/cyclin?e等蛋白復(fù)合物活性促使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的細(xì)胞周期阻滯和衰老進(jìn)程。近年來(lái)，p21作為衰老標(biāo)志物和腫瘤標(biāo)志物其相關(guān)抑制劑研究日益受到科研工作者的重視，
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專(zhuān)利技術(shù)的目的提供一種p21-cdk2/cyclin界面抑制劑的篩選方法，所述抑制劑能夠抑制細(xì)胞衰老。
2、該方法包括以下步驟：
3、1)構(gòu)建一個(gè)包含p21-cdk2/cyclin?a蛋白相互作用模型；
4、2)利用分子動(dòng)力學(xué)軟件計(jì)算步驟1)的模型的結(jié)合自由能、模擬分析出相互作用的氨基酸位點(diǎn)；
5、3)利用分子對(duì)接軟件依據(jù)模擬出的蛋白相互作用氨基酸區(qū)域虛擬篩選出小分子化合物抑制劑；選取對(duì)接打分前100的小分子化合物，依據(jù)小分子化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，挑選出20個(gè)小分子化合物；
6、4)將篩選出的小分子化合物采用細(xì)胞輻射誘導(dǎo)衰老模型進(jìn)行活性驗(yàn)證。
7、優(yōu)選的，上述本專(zhuān)利技術(shù)的篩選方法，所述細(xì)胞衰老是指細(xì)胞輻射損傷后的衰老。
8、優(yōu)選的，上述本專(zhuān)利技術(shù)的篩選方法，步驟1)進(jìn)一步包括利用alphafold蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)和pdb蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)分別構(gòu)建了p21和cdk2/cyclin?a蛋白結(jié)構(gòu)，使用zdock軟件完成p21與cdk2/cyclin?a蛋白復(fù)合物模擬對(duì)接，篩選出與p27-cdk2/cyclin?a蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)最為相似的p21-cdk2/cyclin?a蛋白相互作用模型。
9、優(yōu)選的，上述本專(zhuān)利技術(shù)的篩選方法，步驟2)進(jìn)一步包括采用amber軟件對(duì)步驟1)獲得的蛋白模型進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬、數(shù)據(jù)分析、結(jié)合自由能計(jì)算、熱點(diǎn)氨基酸殘基模擬分析，獲得參與蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)。
10、優(yōu)選的，上述本專(zhuān)利技術(shù)的篩選方法，步驟2)進(jìn)一步包括依據(jù)蛋白相互作用關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)，利用autodock_vina分子對(duì)接軟件虛擬篩選出抑制蛋白-蛋白相互作用的小分子化合物抑制劑。
11、優(yōu)選的，上述本專(zhuān)利技術(shù)的篩選方法，步驟4)所述的驗(yàn)證包括：
12、a)利用gamma射線輻射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bm-msc)，構(gòu)建細(xì)胞輻射誘導(dǎo)衰老模型；
13、b)將步驟3篩選出的小分子化合物與bm-msc共孵育后，采用gamma射線輻射細(xì)胞，通過(guò)β-半乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)或/和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小分子化合物對(duì)細(xì)胞輻射誘導(dǎo)的衰老抑制活性。
14、具體來(lái)說(shuō)，本專(zhuān)利技術(shù)利用alphafold蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)和pdb蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)分別構(gòu)建了p21和cdk2/cyclin?a蛋白結(jié)構(gòu)，然后使用zdock軟件完成p21與cdk2/cyclin?a蛋白復(fù)合物模擬對(duì)接得到多個(gè)對(duì)接模型，并基于文獻(xiàn)報(bào)道的p27-cdk2/cyclin?a晶體結(jié)構(gòu)，從對(duì)接模型中挑選出與p27-cdk2/cyclin?a蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)最為相似的p21-cdk2/cyclin?a蛋白相互作用模型，然后利用amber軟件對(duì)蛋白模型進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬、數(shù)據(jù)分析、結(jié)合自由能計(jì)算、熱點(diǎn)氨基酸殘基模擬分析，明確參與蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基。依據(jù)蛋白相互作用關(guān)鍵區(qū)域氨基酸位點(diǎn)，利用autodock_vina分子對(duì)接軟件虛擬篩選出抑制蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制劑，最終利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選出一種有效抑制細(xì)胞輻射損傷后衰老的小分子抑制劑。目前，通過(guò)靶向細(xì)胞衰老特有信號(hào)通路來(lái)避免健康細(xì)胞走向衰老研究幾乎未見(jiàn)報(bào)道。因此，本專(zhuān)利技術(shù)有望為抗衰老藥物研究提供新的策略。
本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種p21-CDK2/Cycl?in界面抑制劑的篩選方法，所述抑制劑能夠抑制細(xì)胞衰老，該方法包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，所述細(xì)胞衰老是指細(xì)胞輻射損傷后的衰老。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟1)進(jìn)一步包括利用Alphafold蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)和PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)分別構(gòu)建了p21和CDK2/cycl?in?A蛋白結(jié)構(gòu)，使用ZDOCK軟件完成p21與CDK2/cyclin?A蛋白復(fù)合物模擬對(duì)接，篩選出與p27-CDK2/cyclin?A蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)最為相似的p21-CDK2/cyclin?A蛋白相互作用模型。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟2)進(jìn)一步包括采用AMBER軟件對(duì)步驟1)獲得的蛋白模型進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬、數(shù)據(jù)分析、結(jié)合自由能計(jì)算、熱點(diǎn)氨基酸殘基模擬分析，獲得參與蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，所述關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)為Cyclin?A的Gln254和Thr282氨基酸殘基。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟2)進(jìn)一步包括依據(jù)蛋白相互作用關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)，利用A
7.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟4)所述的驗(yàn)證包括：
8.下式化合物或其藥用鹽用于制造抗細(xì)胞衰老藥物中的用途，
9.如權(quán)利要求8所述的用途，所述細(xì)胞衰老是指輻射誘導(dǎo)的衰老。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種p21-cdk2/cycl?in界面抑制劑的篩選方法，所述抑制劑能夠抑制細(xì)胞衰老，該方法包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，所述細(xì)胞衰老是指細(xì)胞輻射損傷后的衰老。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟1)進(jìn)一步包括利用alphafold蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)和pdb蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)分別構(gòu)建了p21和cdk2/cycl?in?a蛋白結(jié)構(gòu)，使用zdock軟件完成p21與cdk2/cyclin?a蛋白復(fù)合物模擬對(duì)接，篩選出與p27-cdk2/cyclin?a蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)最為相似的p21-cdk2/cyclin?a蛋白相互作用模型。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟2)進(jìn)一步包括采用amber軟件對(duì)步驟1)獲得...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李曉亮，張楊楊，向陽(yáng)，冉海亞，李久煊，肖燕妮，陳立，冉茜，李忠俊，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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