【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于檢測，涉及一種鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法(鈷胺素的液相色譜-高分辨質譜聯用分析檢測方法)及其應用。
技術介紹
1、鈷胺素(例如，維生素b12)是一類以復雜的卟啉骨架為基礎，包含鈷離子的有機化合物，其分子量約為1,300-1,500道爾頓，是目前已知的最大非聚合天然生物大分子。鈷胺素的核心結構為一個保守的四吡咯環系統，四吡咯環中心的氮原子以四個配位鍵結合鈷離子形成閉合的咕啉環結構。咕啉環中心的鈷離子通過共價鍵連接一個或兩個可變的軸向功能團，即高位配基和低位配基。咕啉環下端及低位配體的另一端由核苷酸環側鏈連接。目前已經發現了高達18種天然鈷胺素，其結構多樣性主要表現在低位配基上，通常為苯并咪唑、酚類或者嘌呤類化合物中的一種(圖1)。作為一種金屬型輔酶因子，鈷胺素廣泛參與到氨基酸、dna和脂肪酸的生物合成以及碳、鹵素和重金屬的生物地球化學循環過程中。維生素b12作為天然鈷胺素的最典型代表，在紅血球生成、dna合成和神經系統功能中發揮著重要作用。例如，維生素b12缺乏不僅會導致巨幼細胞性貧血及不可逆的神經損傷，也可能加速老年癡呆的發展，這使其在醫學和營養學中獲得了更廣泛的關注。然而，自然界中僅有少數細菌和古菌(約37％)能夠從頭合成鈷胺素，研究表明其結構上的微小差異可能顯著影響依賴鈷胺素生物的生長和代謝能力。因此，建立鈷胺素的高靈敏定性定量分析方法，不僅有助于深入理解其生物學功能及其在人體中的作用，也對公共衛生、食品安全以及維系生態系統功能具有重要意義。
2、傳統檢測方法通過測量鈷胺素缺陷型微生物(例如
3、近年發展的液相色譜串聯質譜技術彌補了鈷胺素傳統分析方法中的一些缺陷。但目前大部分質譜分析方法僅針對維生素b12，沒有可應用于其它類型鈷胺素的質譜定性定量分析技術，并且檢測儀器類型也只限于三重四級桿質譜儀。主要原因可能有以下幾個方面：
4、(1)除維生素b12外，沒有其它商業化鈷胺素標準品；(2)鈷胺素具有復雜的結構和多樣的高分子量衍生物，這使得其分離和鑒定變得困難；(3)鈷胺素在普通質譜儀器中的離子化效率較低，導致檢測靈敏度不夠，尤其是在低濃度樣品中，這限制了其應用；(4)基于mrm(多反應監測)技術的常規質譜定量方法只能對有限的和分子量確定的目標化合物進行定量分析。因此，對高分子量和結構多樣的鈷胺素進行質譜分析存在著很大的挑戰性。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法及其應用。
2、為實現上述目的，本專利技術需要解決的技術問題是，
3、一種鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，以環境中常見的三種不同結構的天然鈷胺素作為標準品，采用全掃描-自動觸發二級質譜掃描(full?scan-ddms2)的質譜采集方式，獲得鈷胺素母離子和高豐度的系列特征離子碎片數據，根據相同鈷胺素碎片具有相同的碎片離子m/z的原則(精確小數點后三位)和compound?discoverer?3.0軟件的碎片離子搜索功能達到鑒定未知鈷胺素結構的目的；然后采用平行反應監測(prm)的質譜定量方法，通過四級桿過濾掉大量干擾離子，并將豐度最高且具有辨識度的鈷胺素低位配體碎片離子作為定量離子，對待測定樣本中的鈷胺素種類和含量進行分析。
4、所述的標準品為維生素b12，5-羥基苯并咪唑型b12，5-甲氧基苯并咪唑型b12。
5、首先采用uhplc-esi-q-orbitrap的full?scan-ddms2的質譜采集方法對樣品中的鈷胺素進行定性分析。full?scan中，可獲得鈷胺素標準品中的母離子；ddms2中，所有的母離子全部進入碰撞池進行高能裂解，進而產生一系列鈷胺素特征碎片離子。根據相同鈷胺素碎片結構具有相同的碎片離子m/z原則(精確小數點后三位)和compound?discoverer軟件的碎片離子搜索功能，達到對待測樣本中所包含的鈷胺素結構類型進行鑒定的目的。
6、full?scan-ddms2質譜采集鑒定鈷胺素結構所用到的檢測條件如下，
7、液相色譜條件：
8、儀器為vanquish超高效液相色譜儀；色譜柱為hypersil?gold?c18柱(2.1mm×100mm,2.6μm,美國thermo?fisher公司)；流動相由0.1％(v/v)甲酸水溶液(流動相a)和乙腈(流動相b)組成；流速為0.3ml/min；柱溫：30℃；梯度洗脫條件為初始5％流動相b和95％流動相a在2.8min內升至15％流動相b，運行4.5min內線性上升至25％流動相b，25％流動相b繼續升高至70％，隨后70％流動相b在0.5min內降為5％流動相b，以5％流動相b維持1.5min；
9、質譜條件：
10、儀器為thermo?q-exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨串聯質譜儀；電噴霧離子源(esi)；掃描方式為full?scan-ddms2；正離子掃描模式；噴霧電壓：3.8kv；源溫度：350℃；一級掃描質譜分辨率為70,000；一級掃描范圍為m/z?200-2,000；一級掃描c-trap最大容量(agc?target)和最大注入時間：3×106和100ms；鞘氣與輔助氣體壓力分別為40和10unit；掃描分析時間為8min；二級掃描范圍為m/z?90-1,400；離子裂解模式和能量：高能碰撞池(ecd)和30ev；二級掃描分辨率均為17,500；二級掃描c-trap最大容量和最大注入時間：1×105和50ms。
11、所述full?scan-ddms2的質譜采集方式為經全掃描后可獲得鈷胺素母離子，其中，維生素b12標準品的母離子為：[m+2h]2+(m/z
12、678.288)和[m+h]+(m/z?1355.577)；5-羥基苯并咪唑型b12的母離子為：[m+2h]2+(m/z?672.270)和[m+h]+(m/z?1343.538)；5-甲氧基苯并咪唑型b12的母離子為：[m+2h]2+(m/z?679.278)和[m+h]+(m/z?1357.557)；
13、同時經自動觸發二級質譜掃描可獲得鈷胺素特征碎片離子，其中，用于鑒定鈷胺素結構的所有標準品碎片離子為(具體為，采用full?scan-ddms2的質譜掃描方式，所有母離子不經過四極桿選本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：以環境中常見的三種不同結構的天然鈷胺素作為標準品，采用全掃描-自動觸發二級質譜掃描(Fullscan-ddMS2)的質譜采集方式，獲得鈷胺素母離子和高豐度的系列特征離子碎片數據，根據相同鈷胺素碎片具有相同的碎片離子m/z的原則和Compound?Discoverer?3.0軟件的碎片離子搜索功能達到鑒定未知鈷胺素結構的目的；然后采用平行反應監測(PRM)的質譜定量方法，通過四級桿過濾掉大量干擾離子，并將豐度最高且具有辨識度的鈷胺素低位配體碎片離子作為定量離子，對待測定樣本中的鈷胺素種類和含量進行分析。
2.根據權利要求1所述的鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：所述的標準品為維生素B12，5-羥基苯并咪唑型B12，5-甲氧基苯并咪唑型B12。
3.根據權利要求1所述的鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：所述Fullscan-ddMS2的質譜采集方式為經全掃描后可獲得鈷胺素母離子，其中，維生素B12標準品的母離子為：[M+2H]2+(m/z?678.288)和[M+H]+(m/z
4.根據權利要求1和3所述的鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：所述Compound?Discoverer軟件通過離子碎片搜索功能鑒定到m/z?147.093，136.056，149.072分別代表維生素B12，5-羥基苯并咪唑型B12及5-甲氧基苯并咪唑型B12的低位配體離子[base+H]+；m/z?359.099，347.064，361.079分別代表三種鈷胺素的含低位配體的磷酸核糖苷結構部分的離子[phosphoriboside+H]+；m/z?997.448對應三種鈷胺素的含咕啉環但去除含低位配體的磷酸核糖苷結構部分的離子[M-phosphoriboside+H]+；m/z?456.729和912.438對應在m/z?997.448基礎上減C3H6N2O的離子；m/z?1209.476代表三種鈷胺素的不含低位配體結構部分的離子[M–base+H]+；m/z?1124.442代表在m/z?1209.476基礎上減C3H6N2O的離子。
5.根據權利要求1或3所述的鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：所述的Fullscan-ddMS2質譜采集定性鈷胺素方式所用到的檢測條件。
6.根據權利要求1或4所述的鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：所述PRM的質譜定量方式為在inclusionlist中輸入權利3中獲得的鈷胺素母離子，經高能碰撞碎裂后可獲得高分辨二級質譜圖，以豐度最高且具有辨識度的低位配體作為鈷胺素定量離子。
7.根據權利要求1或6所述的鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：所述的PRM質譜采集定量鈷胺素方式所用到的檢測條件。其中，液相色譜分析條件與權利要求5中完全一致。
8.根據權利要求1、3或6所述的鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：測定生物樣品中的鈷胺素前需要進行樣品前處理步驟，取經由前處理后的上清液進行液相色譜-高分辨率質譜聯用儀的Fullscan-ddMS2和PRM掃描分析。
...【技術特征摘要】
1.一種鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：以環境中常見的三種不同結構的天然鈷胺素作為標準品，采用全掃描-自動觸發二級質譜掃描(fullscan-ddms2)的質譜采集方式，獲得鈷胺素母離子和高豐度的系列特征離子碎片數據，根據相同鈷胺素碎片具有相同的碎片離子m/z的原則和compound?discoverer?3.0軟件的碎片離子搜索功能達到鑒定未知鈷胺素結構的目的；然后采用平行反應監測(prm)的質譜定量方法，通過四級桿過濾掉大量干擾離子，并將豐度最高且具有辨識度的鈷胺素低位配體碎片離子作為定量離子，對待測定樣本中的鈷胺素種類和含量進行分析。
2.根據權利要求1所述的鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：所述的標準品為維生素b12，5-羥基苯并咪唑型b12，5-甲氧基苯并咪唑型b12。
3.根據權利要求1所述的鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：所述fullscan-ddms2的質譜采集方式為經全掃描后可獲得鈷胺素母離子，其中，維生素b12標準品的母離子為：[m+2h]2+(m/z?678.288)和[m+h]+(m/z?1355.577)；5-羥基苯并咪唑型b12的母離子為：[m+2h]2+(m/z?672.270)和[m+h]+(m/z?1343.538)；5-甲氧基苯并咪唑型b12的母離子為：[m+2h]2+(m/z?679.278)和[m+h]+(m/z?1357.557)；
4.根據權利要求1和3所述的鈷胺素的高靈敏定量、結構鑒定的方法，其特征在于：所述compound?discoverer軟件通過離子碎片搜索功能鑒定到m/z?147.093，136.056，149.072分別代表維生素b12，5-...
【專利技術屬性】
技術研發人員：金慧娟，嚴俊，李秀穎，王晶晶，崔逸儒，
申請(專利權)人：中國科學院沈陽應用生態研究所，
類型：發明
國別省市：
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