【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，尤其涉及一種去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法。
技術介紹
1、烏司他丁，是新鮮人尿中提取的一種能抑制多種蛋白水解酶活力的糖蛋白，屬于蛋白酶抑制劑，臨床上可用于治療急性胰腺炎，慢性復發性胰腺炎，亦可用于急性循環衰竭的搶救輔助用藥。烏司他丁含有143個氨基酸，其氨基酸序列中的第10位絲氨酸(o-糖基化位點)和第45位天冬酰胺(n-糖基化位點)上有糖鏈，長肽鏈中含有6對二硫鍵。原料藥成品為無色至淡黃色澄清液體，無臭無味，ph值為6.0～7.5，分子量為37000～43000da，樣品總雜應≤2.0％。
2、尿調節素，是一種分子量為95000da，由腎小管髓袢升支(tal)與早期遠曲小管的細胞專門合成的糖蛋白，共由640個氨基酸組成，其中包括48個半胱氨酸殘基，7/8潛在的糖基化位點都被n-連接的復雜多觸角聚糖占據，占1/3分子量。尿調節素在內質網中產生，然后被運送到頂端細胞膜作為gpi-連接分子，最后通過蛋白酶水解切割釋放到尿液中。一個健康人每天分泌出20～70mg的尿調節素，是尿液中含量最高的蛋白。故在尿蛋白產品純化過程中常作為雜質存在，其會影響產品純度，從而影響產品安全性。
3、目前已有許多制備高純度烏司他丁的方法，如cn109553679a公開了一種高純度烏司他丁及其制備方法和含有烏司他丁的藥物組合物，10萬單位/ml的烏司他丁在405nm處的吸光度值不超過0.18，人尿激肽原酶的含量不超過0.0005pnau，重金屬含量不超過1.6μg/ml，細菌內毒素含量不超過6.0eu/ml。
4、綜上所述，如何去除烏司他丁粗制品中的尿調節素，已成為目前本領域亟待解決的問題之一。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，采用強陰離子交換層析的方法，降低烏司他丁粗制品中尿調節素的含量，利用兩者等電點差異可實現尿調節素的分離，尿調節素去除率高達99％，烏司他丁收率不低于90％。
2、為達此目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供了一種去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，所述去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法包括以下步驟：
4、(1)取烏司他丁粗制品加水溶解，過濾取上清；
5、(2)乙醇沉淀步驟(1)中獲得的上清，收集沉淀，加水溶解，過濾取上清，獲得烏司他丁中間體溶液；
6、(3)將所述烏司他丁中間體溶液加入強陰離子交換層析柱中，收集烏司他丁洗脫峰。
7、由于蛋白質在水中的溶解度是由其氨基酸殘基的極性和疏水性決定的，因此當乙醇濃度增加時，它會與水競爭與蛋白質結合，從而降低蛋白質在水中的溶解度，導致蛋白發生沉淀。尿調節素、半乳糖凝集素、尤瑞克林等大多數雜蛋白的疏水性、分子量與烏司他丁差異較大，通過增加乙醇的濃度，可使其與烏司他丁分離。
8、本專利技術通過醇沉步驟去除雜蛋白，并通過強陰離子交換層析的方式，進一步降低烏司他丁粗制品中尿調節素的含量，烏司他丁等電點約為2.6，而尿調節素等電點約為5.0，利用兩者等電點差異可實現尿調節素的分離，尿調節素去除率高達99％，烏司他丁收率不低于90％。
9、優選地，步驟(1)中所述烏司他丁粗制品的制備方法包括：
10、利用大孔型陰離子樹脂吸附人尿液，取樹脂進行裝柱、水沖洗、氯化鈉溶液洗脫、超濾濃縮、硫酸銨沉淀、硅藻土過濾，最后收集沉淀過篩，獲得烏司他丁粗制品。
11、優選地，所述大孔型陰離子樹脂包括配基為季胺基-n+r3的聚苯乙烯樹脂。
12、優選地，步驟(1)所述加水溶解中水的體積為烏司他丁粗制品的2～3倍(例如可以是2倍、2.2倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.8倍或3倍等)。
13、優選地，步驟(2)所述乙醇沉淀前還包括調節步驟(1)中獲得的上清ph至6.0～7.5(例如可以是6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4或7.5等)的步驟。
14、優選地，所述強陰離子交換層析柱的填料包括瓊脂糖和/或大孔徑樹脂，優選高度交聯的瓊脂糖、高剛性瓊脂糖或帶有葡聚糖長鏈的高剛性瓊脂糖中的任意一種或至少兩種的組合。
15、優選地，步驟(3)具體包括：
16、使用平衡液沖洗強陰離子交換層析柱，調節烏司他丁中間體溶液ph至與平衡液ph相同，依次向強陰離子交換層析柱中加入烏司他丁中間體溶液、平衡液和洗脫液，收集烏司他丁洗脫峰。
17、優選地，所述平衡液的ph為3.5～6.0(例如可以是3.5、3.7、3.9、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8或6.0等)，優選為4.0～4.5(例如可以是4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5等)。
18、本專利技術采用ph為3.5～6.0，優選為4.0～4.5的平衡液平衡陰離子交換柱，并將烏司他丁中間體溶液ph值調節至與平衡液ph值一致，使烏司他丁分子帶負電荷，能夠與帶有正電荷的陰離子交換劑相結合，并達到高度富集和濃縮。在此條件下，尿調節素幾乎不帶電荷，不能與帶有正電荷的陰離子交換劑相結合，隨沖洗緩沖流動相流出層析柱，從而使樣品尿調節素含量大大降低。
19、優選地，所述平衡液包括檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液或醋酸-醋酸鈉緩沖液中的任意一種或至少兩種的組合。
20、優選地，所述平衡液的濃度為0.05～0.2mol/l(例如可以是0.05mol/l、0.08mol/l、0.1mol/l、0.12mol/l、0.15mol/l或0.2mol/l等)。
21、優選地，所述洗脫液的ph為6.0～8.0(例如可以是6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0等)。
22、優選地，所述洗脫液中含有0.1～2mol/l(例如可以是0.1mol/l、0.5mol/l、0.8mol/l、1mol/l、1.2mol/l、1.5mol/l或2mol/l等)nacl和0.1～0.5mol/l(例如可以是0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l或0.5mol/l等)磷酸鹽緩沖液。
23、本專利技術提供的洗脫液ph值高于烏司他丁等電點，且洗脫液電導率高于平衡液的電導率。
24、上述各項數值范圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。
25、與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：
26、本專利技術采用ph為3.5～6.0，優選為4.0本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，所述去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，步驟(1)中所述烏司他丁粗制品的制備方法包括：
3.根據權利要求1或2所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，步驟(1)所述加水溶解中水的體積為烏司他丁粗制品的2～3倍。
4.根據權利要求1～3任一項所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，步驟(2)所述乙醇沉淀前還包括調節步驟(1)中獲得的上清pH至6.0～7.5的步驟。
5.根據權利要求1～4任一項所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，所述強陰離子交換層析柱的填料包括瓊脂糖和/或大孔徑樹脂，優選高度交聯的瓊脂糖、高剛性瓊脂糖或帶有葡聚糖長鏈的高剛性瓊脂糖中的任意一種或至少兩種的組合。
6.根據權利要求1～5任一項所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，步驟(3)具體包括：
7.根據權利要求6所述的去除烏司他丁粗制品中尿調
8.根據權利要求6或7所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，所述平衡液包括檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液或醋酸-醋酸鈉緩沖液中的任意一種或至少兩種的組合；
9.根據權利要求6所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，所述洗脫液的pH為6.0～8.0。
10.根據權利要求6或9所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，所述洗脫液中含有0.1～2mol/L?NaCl和0.1～0.5mol/L磷酸鹽緩沖液。
...【技術特征摘要】
1.一種去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，所述去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，步驟(1)中所述烏司他丁粗制品的制備方法包括：
3.根據權利要求1或2所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，步驟(1)所述加水溶解中水的體積為烏司他丁粗制品的2～3倍。
4.根據權利要求1～3任一項所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，步驟(2)所述乙醇沉淀前還包括調節步驟(1)中獲得的上清ph至6.0～7.5的步驟。
5.根據權利要求1～4任一項所述的去除烏司他丁粗制品中尿調節素的方法，其特征在于，所述強陰離子交換層析柱的填料包括瓊脂糖和/或大孔徑樹脂，優選高度交聯的瓊脂糖、高剛性瓊脂糖或帶有葡聚糖長鏈的高剛性瓊脂糖中...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊鈺，賈小剛，侯曉彥，孫鐵，蘇古方，范麗，
申請(專利權)人：江蘇艾迪藥業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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