【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于病原檢測領域，具體涉及檢測水稻惡苗病菌藤倉鐮孢的體系、試劑盒及其方法。
技術介紹
1、水稻惡苗病(bakanae?disease)又稱徒長病，是世界性病害，自1828年日本首次報道后，幾乎在世界各水稻種植區均有發生，在中國稻區分布廣泛，造成不同程度的危害，一般減產10％-20％,嚴重時達50％。水稻惡苗病癥狀主要表現為：苗期徒長、葉片細長呈淡綠色、矮化、死苗；成株期出現根部和莖基部腐爛，嚴重時整株枯死或徒長，長倒生根；水稻灌漿后，發病嚴重的植株籽粒帶菌(粉紅色或白色霉層)。水稻惡苗病致病菌主要是藤倉赤霉復合種gibberella?fujikuroi?species?complex，包括藤倉鐮孢fusarium?fujikuroi、擬輪枝鐮孢f.verticillioides和層出鐮孢f.proliferatum，藤倉鐮孢是最主要的致病菌。惡苗病是種傳病害，主要通過種子帶菌傳播，其次也會通過土壤、帶病植株等傳播。目前來說，對于惡苗病的防治主要通過藥劑處理、生物防治等多種途徑實現。除了上述防治措施以外，還需把好選育關，篩選不帶有惡苗病菌的種子。因此，通過早期檢測選用無病種子是簡單易行且快速有效的預防措施。
2、目前，已經開發出的水稻惡苗病菌的檢測方法，如：形態學鑒定、交配型檢測、真菌毒素檢測、營養體親和性分類、隨機擴增多態dna(random?amplification?ofpolymorphicdna,rapd)和擴增片段長度多態性(amplified?fragment?length?polymorphi
3、目前，熒光定量pcr和普通pcr是檢測水稻惡苗病菌藤倉鐮孢較為有效的方法。但是，對于核酸含量極低即ct值在30-40的樣品，無法百分百確定樣品陰陽性。例如，中國專利cn?110117592a公開了一種基于rpa快速檢測水稻惡苗病菌藤倉鐮孢的方法，但其對藤倉鐮孢菌絲進行檢測其靈敏度濃度為0.8619ng/μl。而中國專利cn?107022624a公開了一種利用環介導等溫擴增方法檢測水稻惡苗病菌藤倉鐮刀菌，檢測最低濃度為0.01ng/μl。但對于水稻惡苗病菌藤倉鐮孢量極少的水稻種子是無法實現早期檢測的。
技術實現思路
1、為了解決現有技術中對水稻惡苗病菌藤倉鐮孢檢測下限較高的問題，本專利技術提供了一種檢測水稻惡苗病菌藤倉鐮孢的體系、試劑盒及其方法，能夠在早期實現水稻惡苗病菌藤倉鐮孢的檢測，從而預防水稻惡苗病。
2、本專利技術采用的技術方案是：一種檢測水稻惡苗病菌藤倉鐮孢的體系，所述體系包括rpa擴增系統、crispr/cas12a檢測系統；所述rpa擴增系統包括針對藤倉鐮孢的rpa引物組；所述crispr/cas12a檢測系統包括cas12a蛋白或其編碼基因、針對藤倉鐮孢的crrna、ssdna報告系統；所述rpa引物組包括序列seq?id?no.1和seq?id?no.2；所述crrna的序列選自seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?id?no.9中的任意一種；所述ssdna報告系統包括ssdna，所述ssdna的一端標記有熒光報告分子或crispr側向層析檢測試紙條報告分子。
3、表1.rpa引物、crrna和ssdna報告系統
4、
5、作為優選，所述ssdna的一端標記有熒光報告分子，另一端標記有熒光淬滅基團。
6、作為優選，所述熒光報告分子選自fam、tet、joe、vic、hex、rox、tamra、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5，oregongreentm、calredtm、red640、texas?red、cyan500、red610、生物素結合材料、alexa?647、alexa?555、5-(2-胺乙基)氨基-1-萘磺酸、四甲基羅丹明、異氰酸四甲基若丹明、異氰酸熒光素、χ-羅丹明中的任意一種。
7、作為優選，所述熒光淬滅基團選自ddq-i、ddq-ii、dabcyl、eclipse、iowa?blackfq、iowablack?rq、bhq1、bhq2、bhq3、qsy7、qsy9、qsy21中的任意一種。
8、作為優選，所述ssdna報告系統序列選自seq?id?no.10或seq?id?no.11中的任意一種，更優選為seq?id?no.10。
9、作為優選，所述crrna的序列為seq?id?no.3。
10、作為優選，所述體系包括rpa擴增系統、crispr/cas12a檢測系統；所述rpa擴增系統包括序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的針對藤倉鐮孢的rpa引物組；所述crispr/cas12a檢測系統包括cas12a蛋白或其編碼基因、序列如seq?id?no.3所示的針對藤倉鐮孢的crrna、序列如seq?id?no.10所示的ssdna報告系統。在具體實施例中，該優選的體系可以對水稻惡苗病菌藤倉鐮孢含量極低的弱陽性及疑似陽性樣品進行高效熒光檢測，靈敏度能夠達到1copy/μl(即3.3×10-7ng/μl)。
11、作為優選，所述體系包括rpa擴增系統、crispr/cas12a檢測系統；所述rpa擴增系統包括序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的針對藤倉鐮孢的rpa引物組；所述crispr/cas12a檢測系統包括cas12a蛋白或其編碼基因、序列如seq?id?no.3所示的針對藤倉鐮孢的crrna、序列如seq?id?no.11所示的ssdna報告系統。在具體實施例中，該優選的體系可以對水稻惡苗病菌藤倉鐮孢含量極低的弱陽性及疑似陽性樣品進行高效crispr側向層析檢測，靈敏度能夠達到100copy/μl(即3.3×10-4ng/μl)。
12、本專利技術還提供了所述的體系的應用，為以下(1)～(4)中的任意一種：
13、(1)鑒定或輔助鑒定待測病菌是否為藤倉鐮孢；
14、(2)制備用于鑒定或輔助鑒定待測病菌是否為藤倉鐮孢的試劑盒；
15、(3)檢測待測生物樣本中是否含有藤倉鐮孢；
16、(4)制備用于檢測待測生物樣本中是否含有藤倉鐮孢的試劑盒。
17、本專利技術還提供了一種檢測水稻惡苗病菌藤倉鐮孢的試劑盒，包括所述的檢測體系。
18、作為優選，所述試劑盒還包括dna提取試劑、rpa緩沖液、醋酸鎂、rnase抑制劑、crispr/cas12a緩沖液、crispr側向層析檢測試紙條中的至少一種。
19、本專利技術還提供了所述的試劑盒的應用，為以下(1)～(2)中的任意一種：
20、(1)鑒定或輔助鑒定待測病菌是否為藤倉鐮孢；
21、(2)檢測待測生物樣本中是否含有藤倉鐮孢。
22、本專利技術還提供了一種利用所述的體系或所述的試劑盒鑒定或輔助鑒定待測病菌是否為藤倉鐮孢的方法，包括如下步驟：本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種檢測水稻惡苗病菌藤倉鐮孢的體系，其特征在于，
2.如權利要求1所述的體系，其特征在于，
3.如權利要求1所述的體系，其特征在于，所述ssDNA報告系統序列選自SEQ?ID?NO.10或SEQ?ID?NO.11中的任意一種。
4.如權利要求1所述的體系，其特征在于，
5.權利要求1～4任一所述的體系的應用，其特征在于，為以下(1)～(4)中的任意一種：
6.一種檢測水稻惡苗病菌藤倉鐮孢的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1～4任一所述的檢測體系。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括DNA提取試劑、RPA緩沖液、醋酸鎂、RNase抑制劑、CRISPR/Cas12a緩沖液、CRISPR側向層析檢測試紙條中的至少一種。
8.如權利要求6所述的試劑盒的應用，其特征在于，為以下(1)～(2)中的任意一種：
9.一種利用權利要求1～4任一所述的體系或權利要求6所述的試劑盒鑒定或輔助鑒定待測病菌是否為藤倉鐮孢的方法，包括如下步驟：
10.一種利用權利要求1～4任一所述的
...【技術特征摘要】
1.一種檢測水稻惡苗病菌藤倉鐮孢的體系，其特征在于，
2.如權利要求1所述的體系，其特征在于，
3.如權利要求1所述的體系，其特征在于，所述ssdna報告系統序列選自seq?id?no.10或seq?id?no.11中的任意一種。
4.如權利要求1所述的體系，其特征在于，
5.權利要求1～4任一所述的體系的應用，其特征在于，為以下(1)～(4)中的任意一種：
6.一種檢測水稻惡苗病菌藤倉鐮孢的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1～4任一所述的檢測體系。
7.如權利要...
【專利技術屬性】
技術研發人員：儲黃偉，曹黎明，張安鵬，程燦，周繼華，牛付安，孫濱，
申請(專利權)人：上海市農業科學院，
類型：發明
國別省市：
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