【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥，尤其涉及一種磁力刺激促進外泌體分泌的方法及其應用。
技術介紹
1、外泌體是一種細胞外囊泡，它們目前被認為是有潛力的檢測生物標志物和生理信號遞送載體。根據起源細胞的不同，它們可以包含細胞的許多成分，包括dna、rna、脂質、代謝物以及胞質和細胞表面蛋白。它們遞送到受體細胞中的蛋白質、代謝物和核酸可有效改變其生物反應，這種以復雜途徑調節細胞生命活動的內在特性提高了它們在許多疾病的治療控制中的潛在效用。目前已有超過100項臨床試驗驗證了人間充質干細胞(mscs)分泌的外泌體在治療多種疾病方面的功效。此外，它們還可以促進膠原蛋白的合成，延緩皮膚衰老；增強內皮細胞的成纖維細胞增殖、遷移和血管生成活性，促進皮膚再生和修復；介導細胞間通訊，抑制膠原蛋白沉積，治療疤痕增生。外泌體易于修飾的特性還增強了其在靶向治療中的潛力，拓寬了其應用場景。盡管mscs衍生的外泌體的治療潛力已經得到驗證，但干細胞培養的高成本、外泌體的生產和分離效率低下以及規模化生產的難題，均對其臨床應用構成了重大挑戰。因此尋找一種合適的策略來促進mscs分泌外泌體有助于進一步推進其臨床應用。
2、目前已經探究了多種方法用于促進間充質干細胞分泌外泌體，主要基于生物、化學調節或者物理因素刺激。但是生物化學調節的方式，例如生長因子等通常成本較為昂貴，同時還會伴隨使用上的不可預測的風險。因此通過物理刺激來促進干細胞分泌外泌體是一個更有應用前景的方向。目前已有的研究結果表明，直接施加外界力學刺激可以增強干細胞分泌外泌體的數量。例如在層流作用下，機械剪切
3、中國專利cn110295142a、cn116024163a均公開了將磁納米直接混合進干細胞培養基中，利用磁納米顆粒物理特性改善外泌體分泌。但是這種方法會導致干細胞吞噬大量磁顆粒，影響細胞活力和生理狀態；同時提取的外泌體中也包含磁納米顆粒，需要額外進行提純分離，影響外泌體的治療有效性。
4、目前借助磁納米顆粒通過磁力刺激干細胞促進外泌體分泌的體系，尚未有報道，這種磁力刺激的方法可以為增強外泌體分泌提供新的思路。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于針對現有技術的上述不足，提供一種磁力刺激促進外泌體分泌的方法及其應用，利用磁納米顆粒作為遠程施加力學刺激的媒介，通過精確控制外界磁場的運動對培養的干細胞施加磁力刺激，顯著提升了外泌體產率。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用了如下技術方案：
3、本專利技術的第一目的是提供一種磁力刺激促進外泌體分泌的方法，包括以下步驟：
4、s1、制備磁性水凝膠，
5、采用磁納米顆粒和丙烯酰胺合成磁性水凝膠，配制水凝膠預聚液后，加入磁納米顆粒水溶液，混合均勻后澆注在模具中，隔絕空氣成膠，成膠后的凝膠片用去離子水沖洗去除多余的磁納米顆粒，即得磁性水凝膠；
6、s2、在磁性水凝膠上的細胞接種，
7、在磁性水凝膠上包被ⅰ型膠原蛋白得膠原蛋白修飾磁性水凝膠，然后將細胞重懸并接種膠原蛋白修飾磁性水凝膠上；
8、s3、動態加載磁場實現遠程磁力刺激細胞，
9、接種細胞后，使用完全培養基培養后換用無血清培養基培養，無血清培養時每隔12h加載1h的磁場，循環3～4次后，將磁性水凝膠及細胞轉移到活細胞工作站中，靜態及動態加載磁場，通過控制活細胞工作站與磁鐵的距離來控制施加磁場的強度；
10、s4、收集細胞上清液，
11、收集步驟s3中經磁力刺激后的細胞的上清液；
12、s5、外泌體的提取與純化
13、將步驟s4中得到的細胞上清液經超速離心法去除死亡細胞和調膜碎片，再進行提取與純化，得到外泌體。
14、進一步的，所述細胞包括人間充質干細胞。
15、進一步的，所述的磁納米顆粒為溶劑熱法制備的，水凝膠預聚液中磁納米顆粒的質量分數為0.3％～2％。
16、進一步的，所述磁納米顆粒的粒徑大學為50～200nm。
17、進一步的，所述i型膠原蛋白為鼠源i型膠原蛋白，所述的膠原蛋白與所述磁性水凝膠間使用異性雙功能蛋白質交聯劑磺基琥珀酰亞胺6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯氨基)己酸酯鍵合。
18、進一步的，步驟s2中，接種細胞前，將膠原蛋白修飾后磁性水凝膠使用pbs沖洗，然后外光滅菌；用pbs洗滌細胞，用體積百分比為0.25％胰蛋白酶溶液消化3～5min，然后將消化的細胞以300g～350g離心3～5min,最后，將細胞重懸并接種在膠原蛋白修飾磁性水凝膠上。
19、進一步的，步驟s3中，采用移動永磁鐵的方式實現磁場的動態加載。
20、進一步的，活細胞工作站與磁鐵的距離為5～15mm，磁感應強度對應80～250mt，加載磁場的周期為1s～6s。
21、進一步的，步驟s4具體為，將步驟s3得到的上清液在4℃條件下進行離心，300g離心10min～15min，去除細胞；接著在2000g離心10min～15min，去除死細胞；再接著在10000g離心10min～15min，去除膜碎片，收集上清液，最后在100000g超速離心60min～70min，獲得的沉淀為外泌體。
22、本專利技術的第二目的是提供上述的磁力刺激促進外泌體分泌的方法制備得到的物質，在制備膠原蛋白、免疫治療藥物中的應用。
23、與現有技術相比，本專利技術的有益效果是：
24、(1)本專利技術提出一種磁力刺激促進外泌體分泌的方法，通過磁場遠距離施加磁力刺激，可以在非接觸的情況下實現對細胞的力學刺激，應用于多種復雜的細胞培養環境。另一方面，磁納米顆粒本身尺寸極小，其產生的移動和變形可以定位到亞細胞尺度，可以均勻、精準地向干細胞施加力學刺激。可大幅提高外泌體分泌效率，加載動態磁場的磁性水凝膠上的細胞與培養在常規細胞培養板上的細胞相比，產生外泌體的數量有明顯的提升，達到10倍以上。
25、(2)采用本專利技術提供的方法制備外泌體，外泌體數量提升顯著。在單個細胞水平上，相同條件下動態磁場加載的磁性水凝膠上的人間充質干細胞與培養在普通培養板上的細胞相比，產生的外泌體數量提升約10倍以上，達到每個細胞約4×105個。
26、(3)本專利技術提供的一種磁力刺激促進外泌體分泌的方法，相比于傳統的改善外泌體分泌的生化方法，不需要生物或化學添加劑，避免改變干細胞及外泌體的生理功能。此方法通過磁場驅動磁納米顆粒運動進而拖拽凝膠變形，可以實現更精確的物理刺激，增加每個細胞產生的外泌體數量，并具備成本低廉、工藝簡單、遠程可控、生物相容性極高等優勢。
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1.一種磁力刺激促進外泌體分泌的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞包括人間充質干細胞。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的磁納米顆粒通過溶劑熱法進行制備，水凝膠預聚液中磁納米顆粒的質量分數為0.3％～2％。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述磁納米顆粒的粒徑大學為50～200nm。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述I型膠原蛋白為鼠源I型膠原蛋白，所述的膠原蛋白與所述磁性水凝膠間使用異性雙功能蛋白質交聯劑磺基琥珀酰亞胺6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯氨基)己酸酯鍵合。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟S2中，接種細胞前，將膠原蛋白修飾后磁性水凝膠使用PBS沖洗，然后外光滅菌；用PBS洗滌細胞，用體積百分比濃度為0.25％胰蛋白酶溶液消化3～5min，然后將消化的細胞以300g～350g離心3～5min，最后，將細胞重懸并接種在膠原蛋白修飾磁性水凝膠上。
7.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟S3中，采用移動永磁鐵
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，加載磁場時活細胞工作站與磁鐵的距離為5～15mm，磁感應強度對應80～250mT，靜態加載磁場時保持固定距離，動態加載磁場的周期為1s～6s。
9.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟S4具體為，將步驟S3得到的上清液在4℃條件下進行離心，300g離心10min～15min，去除細胞；接著在2000g離心10min～15min，去除死細胞；再接著在10000g離心10min～15min，去除膜碎片，收集上清液，最后在100000g超速離心60min～70min，獲得的沉淀為外泌體。
10.如權利要求2-9中任一項所述的磁力刺激促進外泌體分泌的方法制備得到的物質，在制備膠原蛋白、免疫治療藥物中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種磁力刺激促進外泌體分泌的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞包括人間充質干細胞。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的磁納米顆粒通過溶劑熱法進行制備，水凝膠預聚液中磁納米顆粒的質量分數為0.3％～2％。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述磁納米顆粒的粒徑大學為50～200nm。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述i型膠原蛋白為鼠源i型膠原蛋白，所述的膠原蛋白與所述磁性水凝膠間使用異性雙功能蛋白質交聯劑磺基琥珀酰亞胺6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯氨基)己酸酯鍵合。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟s2中，接種細胞前，將膠原蛋白修飾后磁性水凝膠使用pbs沖洗，然后外光滅菌；用pbs洗滌細胞，用體積百分比濃度為0.25％胰蛋白酶溶液消化3～5min，然后將消化的細胞以300g～350g離心3～...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張青川，陳也，王晨，張舒欣，吳尚犬，
申請(專利權)人：中國科學技術大學，
類型：發明
國別省市：
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