本發明專利技術涉及提高TIL細胞的慢病毒轉導效率及轉導穩定性的方法及試劑盒。本發明專利技術涉及生物技術領域。具體地，本發明專利技術提供了一種促進TIL細胞的慢病毒轉導效率及轉導穩定性的方法及試劑盒，包括在慢病毒感染的過程中添加BX?795，可將轉導效率提升至60%以上，還能顯著地提升轉導的穩定性，并且對TIL細胞的活率無明顯影響。本發明專利技術的提高TIL細胞的慢病毒轉導效率及轉導穩定性的方法可應用于獲得基因工程化的TIL細胞，促進TIL細胞療法的發展和應用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體地涉及提高til細胞的慢病毒轉導效率及轉導穩定性的方法及試劑盒。
技術介紹
1、腫瘤浸潤淋巴細胞(til)療法是指從患者自身腫瘤組織中分離與提取免疫細胞，經體外培養和大量擴增后再重新回輸到患者體內，以攻擊和摧毀腫瘤細胞。經過體外培養和擴增的til細胞因具有更強的殺傷功能、多靶點、腫瘤趨向和浸潤能力強、副作用小等優勢，在腫瘤免疫治療中展現出巨大的應用潛力與價值。
2、在臨床應用過程中，免疫抑制性腫瘤微環境往往嚴重削弱了回輸til細胞在體內療效的充分發揮。為解決這一難題，常采用基因修飾或者基因編輯技術對til細胞進行改造，以進一步提高其對腫瘤微環境免疫抑制的抵抗性，增強其對腫瘤的療效。目前，在以car-t細胞為代表的免疫細胞治療產品研究中，常用的病毒載體包括慢病毒和逆轉錄病毒載體，其中慢病毒載體因具有更好的安全性與技術成熟度而被廣泛應用。car-t細胞常來源于患者或健康供者的外周血t淋巴細胞，其大部分處于未分化或幼稚狀態，慢病毒載體對其具有較高且穩定的轉導效率。
3、然而，來自于腫瘤組織的til細胞，尤其是來自晚期患者腫瘤組織的til細胞，往往處于終末分化與耗竭狀態，導致慢病毒載體對til細胞的轉導效率普遍偏低，且隨til細胞的擴增而不斷下降，存在轉導效率不穩定的問題。目前尚未見采用慢病毒載體對til細胞進行高效（如轉導效率50%及以上）且穩定的基因修飾與改造的案例。
4、因此，本領域迫切需要開發一種采用慢病毒載體對til細胞進行高效且穩定的基因修飾與改造的方法。
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br/>技術實現思路
1、本專利技術的目的就是提供一種提高til細胞的慢病毒轉導效率及轉導穩定性的方法。
2、在本專利技術的第一方面，提供了一種獲得慢病毒轉導的til細胞的方法，包括步驟：在慢病毒轉導til細胞的轉導體系中添加促轉導試劑，所述促轉導試劑包括bx-795。
3、在另一優選例中，所述促轉導試劑進一步包括：除bx-795外的其他蛋白激酶tbk1/ikkε抑制劑，例如amlexanox、mrt67307、或其組合。
4、在另一優選例中，所述促轉導試劑進一步包括：lentiboost、polybrene、lentiviral?transduction?enhancer、或其組合。
5、在另一優選例中，所述方法具體包括步驟：
6、a.?提供待轉導的til細胞和慢病毒；
7、b.?將所述待轉導的til細胞接種到擴培完全培養基中，在促轉導試劑存在的條件下，用所述慢病毒轉導所述til細胞；其中，所述促轉導試劑包括bx-795；
8、c.?收集轉導后的細胞；
9、d.?在擴培完全培養基中對步驟c中的細胞進行擴增培養。
10、在另一優選例中，步驟b中，所述bx-795在反應體系中的終濃度為1~10μm，優選地為1.5~6μm，例如1.5~3μm，或3~6μm。
11、在另一優選例中，步驟b中，所述培養基為擴培完全培養基。
12、在另一優選例中，所述擴培完全培養基的成分包括：細胞基礎培養基、血清替代物、l-谷氨酰胺或其替代物、il-2。
13、在另一優選例中，所述擴培完全培養基中il-2的用量為100-600?iu/ml，優選地為300?iu/ml。
14、在另一優選例中，所述細胞基礎培養基為適用于哺乳動物細胞培養的培養基。
15、在另一優選例中，所述細胞基礎培養基選自下組：rpmi?1640培養基、aim-vtm培養基、sfm培養基、x-vivo培養基、或其組合。
16、在另一優選例中，所述細胞基礎培養基包括advanced?rpmi?1640培養基、cts?tmaim-vtm培養基。
17、在另一優選例中，所述細胞基礎培養基為advanced?rpmi?1640培養基和cts?tmaim-vtm培養基1:1混合得到的培養基。
18、在另一優選例中，所述l-谷氨酰胺替代物為gluta?maxtm。
19、在另一優選例中，所述擴培完全培養基中gluta?maxtm的含量為0.5-2%，優選地為1%。
20、在另一優選例中，所述血清替代物為ctstm免疫細胞血清替代物。
21、在另一優選例中，所述擴培完全培養基中ctstm免疫細胞血清替代物的含量為1%-5%，優選地為2.5%。
22、在另一優選例中，步驟a中，所述待轉導的til細胞來源于腫瘤組織。
23、在另一優選例中，所述腫瘤組織優選地為來自腫瘤晚期患者的腫瘤組織。
24、在另一優選例中，所述腫瘤晚期患者是指tnm分期中處于iii期、iv期的患者。
25、在另一優選例中，所述til細胞為處于終末分化與耗竭狀態的til細胞。
26、在另一優選例中，所述待轉導的til細胞是經過bx-795預處理的til細胞，預處理的bx-795的濃度為1μm，預處理時間為4h~16h。
27、在另一優選例中，所述待轉導的til細胞是經過初培的til細胞。
28、在另一優選例中，所述初培在初培培養基中進行，所述初培培養基含有il-2。
29、在另一優選例中，所述初培培養基進一步包括成分：til細胞基礎培養基、緩沖液、血清或血清替代物、l-谷氨酰胺或其替代物、抗生素、以及可選的til細胞激活試劑。
30、在另一優選例中，所述il-2的濃度為100-6000?iu/ml。
31、在另一優選例中，所述til細胞基礎培養基包括：rpmi?1640培養基、sfm培養基、x-vivo培養基。
32、在另一優選例中，所述til細胞激活試劑包括：抗cd3單克隆抗體、抗4-1bb人源化單克隆抗體、或其組合。
33、在另一優選例中，所述抗cd3單克隆抗體的終濃度為10-100?ng/ml、所述抗4-1bb人源化單克隆抗體的終濃度為1-50?μg/ml。
34、在另一優選例中，所述初培培養基包括：rpmi?1640培養基，終濃度為2.5%v/v的緩沖液hepes，終濃度為1%～10%v/v的血清替代物，終濃度為1%v/v的glutamax和0.1%v/v的慶大霉素，6000?iu/ml的il-2。
35、在另一優選例中，所述初培培養基還包括：500-3000?iu/ml的il-2，10-100?ng/ml的抗cd3單克隆抗體、1-50?μg/ml的抗4-1bb人源化單克隆抗體。
36、在另一優選例中，所述慢病毒為vsv-g慢病毒。
37、在另一優選例中，所述慢病毒為搭載了外源目的基因的重組慢病毒。
38、在另一優選例中，所述外源目的基因包括：提升til細胞功能的元件的編碼基因，所述til細胞功能的元件包括：改造或未改造的外源細胞因子、改造或未改造的外源膜蛋白、改造或未改造的外源本文檔來自技高網
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【技術保護點】
1.一種提高TIL細胞的慢病毒轉導效率及轉導穩定性的方法，其特征在于，包括步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B的轉導時間為24-48小時。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述BX-795在步驟B的轉導體系中的終濃度為3~6μM。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待轉導的TIL細胞來源于腫瘤組織。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴培完全培養基的成分包括：細胞基礎培養基、血清替代物、L-谷氨酰胺或其替代物、IL-2。
6.?如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述擴培完全培養基中IL-2的用量為100-600?IU/ml。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴增培養的時間為7~10天。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具有選自下組的一種或多種特征：
9.一種BX-795在制備用于添加至慢病毒轉導TIL細胞的轉導體系中，提高TIL的慢病毒轉導效率及轉導穩定性的試劑中的用途。
10.一種提高TIL細胞的慢病毒轉導效率及轉導穩定性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：（a）促轉導試劑，所述促轉導試劑包括BX-795；（b）擴培完全培養基；和（c）說明書，所述說明書記載了所述試劑盒的使用方法。
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【技術特征摘要】
1.一種提高til細胞的慢病毒轉導效率及轉導穩定性的方法，其特征在于，包括步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b的轉導時間為24-48小時。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述bx-795在步驟b的轉導體系中的終濃度為3~6μm。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待轉導的til細胞來源于腫瘤組織。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴培完全培養基的成分包括：細胞基礎培養基、血清替代物、l-谷氨酰胺或其替代物、il-2。
6.?如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述擴培完全培養基...
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡淵，田煥玲，張新華，趙毅，高青，
申請(專利權)人：青島華賽伯曼醫學細胞生物有限公司，
類型：發明
國別省市：
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