【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程及微生物發酵領域，具體地說，涉及一種產核苷及其衍生物的重組菌的構建方法及其應用。
技術介紹
1、核苷是一類糖苷的總稱。核苷是核酸和核苷酸的組成成分。核苷是由d-核糖或d-z-脫氧核糖與嘧啶堿或嘌呤堿縮合而成。核苷一般為無色結晶，不溶于普通有機溶劑，易溶于熱水，熔點為160～240℃。由d-核糖生成的核苷稱核糖核苷，參與rna組成，由d-α-脫氧核糖生成的核苷稱脫氧核糖核苷，參與dna組成。d-核糖與腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶縮合生成相應的腺嘌呤核糖核苷、鳥嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它們分別簡稱為腺苷(a)、鳥苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。
2、鳥嘌呤核苷(鳥苷)和次黃嘌呤核苷(肌苷)在食品和醫藥行業有著廣泛的作用。在食品領域，鳥苷和肌苷分別是鳥苷酸二鈉和肌苷酸二鈉的重要前體，而鳥苷酸二鈉與肌苷酸二鈉組合使用作為食品增鮮劑，廣泛應用于雞精、醬油等調味品中。在醫藥領域，鳥苷和肌苷可以作為多種抗病毒藥物的醫藥中間體，如無環鳥苷、三氮唑核苷、三磷酸鳥苷鈉等都需要鳥苷作為合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前體，而肌苷酸可以作為合成腺苷酸(amp)和鳥苷酸(gmp)的前體，適用于各種原因引起的白細胞減少癥、血小板減少癥、各種心臟疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外還可治療中心視網膜炎、視神經萎縮等。
3、目前，微生物發酵是生產核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或短小芽孢桿菌等。在生長菌株的選育與改造過程中
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種產核苷及其衍生物的重組菌的構建方法及其應用。
2、為了實現本專利技術目的，第一方面，本專利技術提供一種修飾的微生物，所述微生物相比于未修飾的微生物，其核酮糖磷酸3-差向異構酶的活性降低或喪失，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強的核苷生產能力。
3、本專利技術中，來自于解淀粉芽孢桿菌的核酮糖磷酸3-差向異構酶(ribulose-phosphate?3-epimerase)在ncbi上的參考序列編號為cbi42777.1，來自于枯草芽孢桿菌的核酮糖磷酸3-差向異構酶在ncbi上的參考序列編號為cab13452.1(由rpe基因編碼)。
4、進一步地，微生物中的核酮糖磷酸3-差向異構酶的活性降低或喪失是由選自以下1)-3)，或任選的組合實現的：
5、1)通過改變所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的氨基酸序列而降低或喪失；
6、2)通過改變編碼所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的核苷酸序列而降低或喪失；
7、3)通過敲除所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼序列而喪失。
8、進一步地，采用誘變、定點突變或同源重組的方法來降低所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因的表達或敲除所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因。
9、在本專利技術的具體實施方式中，核酮糖磷酸3-差向異構酶活性降低或喪失是通過如下a、b、c或d來實現的：
10、a、核酮糖磷酸3-差向異構酶第77位氨基酸由s突變為a；
11、b、核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因的起始密碼子由atg突變為gtg或ttg；
12、c、將核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因的整個orf框完全敲除或將orf框內的任意氨基酸突變成終止密碼子導致的失活(如起始密碼子atg突變為taa，第171位氨基酸發生終止突變使該基因編碼的蛋白活性低于野生型)；
13、d、將核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因的密碼子進行優化，優化的密碼子的核苷酸突變點包括g168a、t192c、a252g、c264t。
14、所述微生物可以是枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(bacillus?amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(bacillus?pumilus)或大腸桿菌(escherichia?coli)等。例如，出發菌株為b.subtilis?168、b.subtilis?a5(菌株b.subtilis?a5構建方法參見cn110257315b)、b.a?833和b.a?836(參見cn112574934a)。
15、第二方面，本專利技術提供產核苷及其衍生物的重組菌的構建方法，所述方法包括：利用基因工程手段，失活或弱化具有核苷生產能力的微生物中的核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因。
16、所述弱化選自以下a)-c)，或任選的組合實現的：
17、a)通過改變所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的氨基酸序列而降低或喪失；
18、b)通過改變編碼所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的核苷酸序列而降低或喪失；
19、c)通過敲除所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼序列而喪失。
20、弱化的方法可選自誘變、定點突變、同源重組等中的至少一種。
21、優選地，弱化是通過如下①、②、③或④實現的：
22、①核酮糖磷酸3-差向異構酶第77位氨基酸由s突變為a；
23、②核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因的起始密碼子由atg突變為gtg或ttg；
24、③將核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因的整個orf框完全敲除或將orf框內的任意氨基酸突變成終止密碼子導致的失活(如起始密碼子atg突變為taa，第171位氨基酸發生終止突變使該基因編碼的蛋白活性低于野生型)；
25、④將核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因的密碼子進行優化，優化的密碼子的核苷酸突變點包括g168a、t192c、a252g、c264t；
26、第三方面，本專利技術提供按照所述方法構建得到的重組菌。
27、第四方面，本專利技術提供所述微生物或按照所述方法構建得到的重組菌在核苷或核苷衍生物發酵生產或提高核苷或核苷衍生物發酵產量中的應用。
28、本專利技術所述核苷或核苷衍生物包括但不限于肌苷、鳥苷、次黃嘌呤、肌苷酸、鳥嘌呤、鳥苷酸、核黃素、二乙酰鳥苷酸等。
29、第五方面，本專利技術提供一種生產核苷的方法，所述方法包括如下步驟：
30、i)培養所述微生物或按照所述方法構建得到的重組菌，獲得培養物；
31、ii)從步驟i)中獲得的所述培養物中收集所產生的核苷。
32、借由上述技術方案，本專利技術至少具有下列優點及有益效果：
33、本專利技術通過修飾枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌的核酮糖磷酸3-差向異構酶(由rpe基因編碼)，使得rpe蛋白活性減弱，使得微生物能本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種修飾的微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修飾的微生物，其核酮糖磷酸3-差向異構酶的活性降低或喪失，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強的核苷生產能力；
2.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，微生物中的核酮糖磷酸3-差向異構酶的活性降低或喪失是由選自以下1)-3)，或任選的組合實現的：
3.根據權利要求2所述的微生物，其特征在于，采用誘變、定點突變或同源重組的方法來降低所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因的表達或敲除所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因。
4.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，核酮糖磷酸3-差向異構酶活性降低或喪失是通過如下A、B、C或D來實現的：
5.根據權利要求1-4任一項所述的微生物，其特征在于，所述微生物為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)或大腸桿菌(Escherichia?coli)。
6.產核苷及其衍生物的重組菌的構建方法，其特
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，弱化的方法選自誘變、定點突變、同源重組中的至少一種；
8.按照權利要求6或7所述方法構建得到的重組菌。
9.權利要求1-5任一項所述微生物或權利要求8所述重組菌在核苷或核苷衍生物發酵生產或提高核苷或核苷衍生物發酵產量中的應用；
10.一種生產核苷的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
...【技術特征摘要】
1.一種修飾的微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修飾的微生物，其核酮糖磷酸3-差向異構酶的活性降低或喪失，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強的核苷生產能力；
2.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，微生物中的核酮糖磷酸3-差向異構酶的活性降低或喪失是由選自以下1)-3)，或任選的組合實現的：
3.根據權利要求2所述的微生物，其特征在于，采用誘變、定點突變或同源重組的方法來降低所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因的表達或敲除所述核酮糖磷酸3-差向異構酶的編碼基因。
4.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，核酮糖磷酸3-差向異構酶活性降低或喪失是通過如下a、b、c或d來實現的：
5.根據權利要求1-4任一項所述的微生物，其特征在于，所述微生物為枯草芽孢桿菌(bacillu...
【專利技術屬性】
技術研發人員：薛婷莉，吳濤，劉燦彬，呂言，張孟娟，王靖蓉，趙津津，李巖，
申請(專利權)人：廊坊梅花生物技術開發有限公司，
類型：發明
國別省市：
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