【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及醫(yī)學生物材料，具體涉及一種水生動物源脫細胞基質及其制備方法和應用。
技術介紹
1、脫細胞基質（ecm）指通過脫細胞技術對組織或器官去除細胞后獲得的細胞外基質支架，具有與自然組織相似的超微結構，同時因其免疫原性低及富含多種生長因子，并傳遞物理、化學和生物信號等多種優(yōu)點，而利于細胞黏附、增殖、遷移、分化及血管新生，從而促進組織再生。
2、目前市場上常見的脫細胞真皮基質一般來源于豬、牛、羊和馬，它們的制作工藝和臨床應用已趨于完善。
3、人類同種異體脫細胞基質也是一種良好的原位組織修復材料，在臨床研究中顯示出了優(yōu)秀的促修復特性。然而直至目前，人類來源的所有器官組織仍然面臨嚴峻的供給缺乏。因此，這類同種來源生物材料的應用仍將受到供體不足問題的巨大限制。
4、水生動物源脫細胞基質由于具有抗原性低、生物安全性高以及品類和產量豐富的特點，近年已成為國內外研究的熱點之一。水生動物源脫細胞基質具有與豬、牛等哺乳動物類似的仿生結構，含有更為豐富脂肪和ω-3不飽和脂肪酸，可有效降低炎癥反應、促進創(chuàng)面區(qū)域新生血管的生成，在如難愈性創(chuàng)面修復等領域具有明顯促進作用。
5、脫細胞基質由動物源組織經脫細胞工藝制備而成，根據基質內細胞的數(shù)量和分布情況，脫細胞工藝或多或少都會對基質結構造成一定影響。水生動物源脫細胞基質中脯氨酸、羥脯氨酸等亞氨基酸含量較低，材料穩(wěn)定性相較陸生動物源脫細胞基質弱，在不適宜的過度工藝條件下易造成脫細胞基質仿生結構喪失。
6、專利cn112755247b公開了一種脫細
7、專利cn108355171b公開了脫細胞真皮基質引導組織再生膜材料及其制備方法和應用，將魚組織浸酸后去表皮并制備疏松面，并以氯化鈉溶液作為后續(xù)穩(wěn)定劑。由于水生動物組織結構穩(wěn)定性弱，酸溶液勢必會導致細胞基質核心成分膠原纖維被破壞溶出，即便后續(xù)引入鹽溶液做穩(wěn)定劑，但仿生結構已發(fā)生不可逆的破壞。
8、現(xiàn)有技術在前期去雜過程中，或引入酸堿過度破壞基質結構，或無充分考慮到對可能引發(fā)免疫成分的雜組織的充分去除，因此在脫細胞過程不可避免需要采用多道工序控制，這也造成基質結構的明顯破壞。有鑒于此，特提出本專利技術。
技術實現(xiàn)思路
1、為解決現(xiàn)有技術中水生脫細胞基質仿生結構維持和低生物安全風險難兼得的難題，本專利技術提供了一種水生動物源脫細胞基質及其制備方法和應用。
2、具體的，本專利技術的技術方案如下：
3、第一方面，本專利技術提供了一種水生動物源脫細胞基質，所述水生動物源脫細胞基質由水生動物結締組織經預處理和脫細胞處理后制得；所述預處理的方法包括：使用生物酶在0-15℃溫度條件下酶解12-60h，優(yōu)選酶解12-18?h或18-21h或24-48h，隨后去除肌肉組織、基底膜和表皮層，得到無雜組織的真皮組織。
4、本專利技術在低溫條件下對水生動物結締組織進行生物酶酶解，利用生物酶在低溫條件下的溫和性實現(xiàn)對雜組織的松解，并在脫細胞前去除水生動物組織中的富細胞成分雜質，且不造成基質組織損傷，再配合后續(xù)脫細胞處理，獲得的水生動物源脫細胞基質具有和動物原組織類似或一致的仿生結構，且不含可能引發(fā)免疫風險的成分，臨床安全有效性高。
5、在本專利技術中：
6、優(yōu)選地，所述生物酶選自彈性蛋白酶、iv型膠原酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酪氨酸酶、中性蛋白酶中的至少一種。
7、優(yōu)選地，每種生物酶在酶解體系中的濃度為0.001-0.01%優(yōu)選為0.004-0.006%或0.003-0.005%。
8、優(yōu)選地，所述酶解體系的溶劑選自磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中的至少一種。
9、進一步地，在本專利技術中：
10、優(yōu)選地，所述酶解體系為0.004-0.006%的彈性蛋白酶磷酸鹽或彈性蛋白酶三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液；酶解時間為12-18h。
11、或者，作為另一種優(yōu)選，所述酶解體系為0.003-0.005%的胰蛋白酶硼酸鹽或胰蛋白酶磷酸鹽溶液；酶解時間為15-21h。
12、進一步地，在本專利技術中：
13、優(yōu)選地，所述無雜組織的真皮組織無肉眼可見的帶色成分。
14、和本領域已知水生動物源脫細胞基質產品相比，本專利技術提供的水生動物源脫細胞基質的吸水率和原組織接近，說明結構沒有發(fā)生明顯變化。同時，本專利技術預處理方法獲得的真皮組織在后續(xù)脫細胞處理后的dna殘留含量低，說明本專利技術提供的水生動物源脫細胞基質的脫細胞水平相較更高。
15、進一步地，在本專利技術中：
16、優(yōu)選地，所述預處理的方法還包括，將得到的真皮組織用2-10℃預冷的保護溶液浸潤，再進行脫細胞處理；所述保護溶液選自磷酸鹽緩沖液、氯化鈉溶液、硼酸鹽緩沖液中的至少一種，濃度為0.5-1.5%。
17、優(yōu)選地，所述脫細胞處理選用物理方法或化學方法。
18、在所述的物理方法中，不包含致蛋白變性的高壓處理、激光處理、高速勻化剪切和紫外照射。
19、在所述化學方法中，所用試劑不包含致蛋白變性成分，所述致蛋白變性成分優(yōu)選為濃鹽酸、尿素、鹽酸胍、十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇、二甲基亞砜。
20、鑒于前述預處理步驟獲得的真皮組織更有利于后續(xù)脫細胞處理效果，本專利技術無需多次反復的脫細胞程序，僅利用單一且簡單的物理或化學脫細胞方式即可，節(jié)約時間及經濟成本的同時，更有利于降低對仿生結構的不良影響。
21、進一步地，在本專利技術中：
22、優(yōu)選地，所述脫細胞處理后還包括清洗步驟：先用15-25℃純化水浸洗0.5-4h，再用4-10℃預冷純化水浸洗24-72h。
23、本專利技術提供的水生動物源脫細胞基質優(yōu)選以水生動物如魚類的皮膚組織為基礎材料；最終獲得的水生動物源脫細胞基質為具有不規(guī)則蜂窩狀多孔或片層狀的微觀結構，吸水率為自身重量的2~8倍。
24、在本專利技術提供的一個具體實施方式中，所述水生動物源脫細胞基質的總蛋白含量為85-99%，更優(yōu)選為90-98%，更優(yōu)選為92-97%。
25、在本專利技術提供的一個具體實施方式中，在所述水生動物源脫細胞基質的纖維性蛋白中，i型膠原蛋白的含量為75-90%；和/或，iv型膠原蛋白的含量≤0.5%，優(yōu)選為0-0.1%。
26、在本專利技術提供的一個具體實施方式中，所述水生動物源脫細胞基質的凍干品的熱變性溫度為35-50℃，優(yōu)選為40-48℃。
27、在本專利技術提供的一個具體實本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述水生動物源脫細胞基質由水生動物結締組織經預處理和脫細胞處理后制得；所述預處理的方法包括：使用生物酶在0-15℃溫度條件下酶解12-60h，優(yōu)選酶解12-18?h或18-21h或24-48h，隨后去除肌肉組織、基底膜和表皮層，得到無雜組織的真皮組織。
2.根據權利要求1所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述生物酶選自彈性蛋白酶、IV型膠原酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酪氨酸酶、中性蛋白酶中的至少一種；
3.根據權利要求2所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述酶解體系的溶劑選自磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中的至少一種。
4.根據權利要求2或3所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述酶解體系為0.004-0.006%的彈性蛋白酶磷酸鹽或彈性蛋白酶三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液；酶解時間為12-18h；
5.根據權利要求1-4任意一項所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述無雜組織的真皮組織無肉眼可見的帶色成分。
6.根據權利要求1-5任意一項所述水生動物源脫細
7.根據權利要求1-6任意一項所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述脫細胞處理選用物理方法或化學方法；
8.根據權利要求1-7任意一項所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述脫細胞處理后還包括清洗步驟：先用15-25℃純化水浸洗0.5-4h，再用4-10℃預冷純化水浸洗24-72h。
9.根據權利要求1-8任意一項所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述水生動物源脫細胞基質的總蛋白含量為85-99%，優(yōu)選為90-98%，更優(yōu)選為92-97%；
10.根據權利要求1-9任意一項所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述水生動物的結締組織為水生動物的皮膚組織，優(yōu)選為水生魚類的皮膚組織。
11.權利要求1-10任意一項所述水生動物源脫細胞基質的制備方法，其特征在于，所述水生動物源脫細胞基質由水生動物結締組織經預處理和脫細胞處理后制得；所述預處理的方法包括：使用生物酶在10-15℃溫度條件下酶解12-60h，去除肌肉組織、基底膜和表皮層，得到無雜組織的真皮組織。
12.權利要求1-10任意一項所述水生動物源脫細胞基質在用于急性或慢性創(chuàng)面修復、殘腔填充、受損組織覆蓋、止血、軟骨缺損修復或骨缺損輔助修復的產品中的應用；
...【技術特征摘要】
1.水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述水生動物源脫細胞基質由水生動物結締組織經預處理和脫細胞處理后制得；所述預處理的方法包括：使用生物酶在0-15℃溫度條件下酶解12-60h，優(yōu)選酶解12-18?h或18-21h或24-48h，隨后去除肌肉組織、基底膜和表皮層，得到無雜組織的真皮組織。
2.根據權利要求1所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述生物酶選自彈性蛋白酶、iv型膠原酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酪氨酸酶、中性蛋白酶中的至少一種；
3.根據權利要求2所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述酶解體系的溶劑選自磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中的至少一種。
4.根據權利要求2或3所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述酶解體系為0.004-0.006%的彈性蛋白酶磷酸鹽或彈性蛋白酶三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液；酶解時間為12-18h；
5.根據權利要求1-4任意一項所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述無雜組織的真皮組織無肉眼可見的帶色成分。
6.根據權利要求1-5任意一項所述水生動物源脫細胞基質，其特征在于，所述預處理的方法還包括，將得到的真皮組織用2-10℃預冷的保護溶液浸潤，再進行脫細胞處理；所述保護溶液選自磷酸鹽緩沖液、氯化鈉溶液、硼酸...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：傅維擎，馮嬌燕，黃兆輝，
申請(專利權)人：煙臺德勝海洋生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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