【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及病毒純化濃縮，尤其涉及一種牛副流感病毒3型的純化濃縮方法。
技術介紹
1、牛副流感病毒3型（bovine?parainfluenza?virus?type3，bpiv3）為單鏈負股有囊膜rna病毒，是引起牛和其他反芻動物急性呼吸道疾病的主要病原體之一。疫苗接種是牛副流感病毒3型預防的重要手段，病毒液的純化濃縮是疫苗生產過程中的關鍵步驟。
2、目前，病毒的懸浮培養工藝已經成為疫苗、抗體等生物制品的主流生產方法，懸浮培養工藝在抗原生產過程中的可控性更高，生產的抗原不僅產量可觀，且抗原批次間差異小，使產品質量穩定提升。但是，懸浮培養工藝生產的抗原雜蛋白含量非常高，是貼壁培養生產抗原雜蛋白含量的幾十倍至幾百倍，雜蛋白的存在嚴重影響了疫苗的安全性。因此，針對懸浮培養的牛副流感病毒3型病毒液開發高效的純化濃縮方法具有重要意義。
技術實現思路
1、本專利技術提供一種牛副流感病毒3型的純化濃縮方法。
2、本專利技術針對懸浮培養獲得的牛副流感病毒3型病毒液開發高效的純化濃縮方法，由于懸浮培養獲得的病毒液中存在大量的雜蛋白，通常需要多步純化才能有效去除雜蛋白，但多步純化會導致病毒損失增加、病毒免疫原性下降。在研發過程中，本專利技術意外地發現，采用中空纖維柱對懸浮培養獲得的牛副流感病毒3型病毒液進行純化濃縮，并采用特定梯度的洗濾體積進行洗濾，能夠在顯著提高雜蛋白去除效率的同時，保證較高的病毒回收率。
3、具體地，本專利技術提供以下技術方案：
5、所述純化濃縮包括三次洗濾，所述三次洗濾使用的洗濾液體積依次遞減，其中，第一次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的5-10倍，第二次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的2-5倍，第三次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的1-2倍。
6、上述方法中，三次洗濾使用的洗濾液體積依次遞減是指第一次洗濾使用的洗濾液體積大于第二次洗濾使用的洗濾液體積，第二次洗濾使用的洗濾液體積大于第三次洗濾使用的洗濾液體積。
7、本專利技術發現，采用中空纖維柱配合上述洗濾體積梯度進行洗濾，能夠在顯著提高雜蛋白去除效率的同時，保證較高的病毒回收率。
8、作為本專利技術的一種優選實施方式，第一次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的5-6倍，第二次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的2-3倍，第三次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的1-1.5倍。
9、作為本專利技術的另一種優選實施方式，第一次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的9-10倍，第二次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的5-6倍，第三次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的2-3倍。
10、上述方法中，在濃縮至終體積后進行上述三次洗濾，在三次洗濾后，收集濃縮后的液體，即得到純化濃縮的牛副流感病毒3型病毒液。
11、上述方法中，所述濃縮體積為純化濃縮結束時獲得的濃縮病毒液的體積。
12、上述方法中，所述洗濾液為pbs。
13、優選地，所述pbs的濃度為0.1-0.15mol/l。采用該濃度范圍的pbs進行洗濾能夠更有效地去除雜蛋白。
14、優選地，所述pbs的ph為7.3-7.4。
15、優選地，所述中空纖維柱的截留分子量為500-750kd。
16、上述方法中，所述純化濃縮的濃縮倍數優選為5-10倍。
17、本領域技術人員可根據初始病毒液的體積在上述范圍內調整并選擇合適的濃縮倍數，根據初始病毒液體積和濃縮倍數計算最終獲得的濃縮病毒液的體積。
18、本專利技術中，所述病毒液為經懸浮培養獲得的病毒液。經懸浮培養獲得的病毒液即為懸浮培養結束時收集的病毒培養液。
19、優選地，所述經懸浮培養獲得的病毒液的蛋白含量為1-10?mg/ml；優選為3-9?mg/ml。
20、進一步優選地，所述經懸浮培養獲得的病毒液的tcid50/0.1ml為6-8，蛋白含量為6-9mg/ml。
21、上述方法還包括：在純化濃縮前，先將經懸浮培養獲得的病毒液進行澄清處理。
22、澄清處理的目的主要在于去除細胞碎片及部分雜蛋白。但澄清處理對雜蛋白的去除作用有限，經澄清處理的病毒液仍含有較多的雜蛋白。
23、優選地，所述澄清處理為將經懸浮培養獲得的病毒液進行離心。
24、優選地，經澄清處理的病毒液應保持在4~6℃。
25、在本專利技術的一些實施方式中，所述純化濃縮方法包括如下步驟：
26、（1）將懸浮培養獲得的牛副流感病毒3型病毒液離心去除細胞碎片及部分雜蛋白得到澄清的病毒液；
27、（2）將經澄清的病毒液采用500~750kd中空纖維柱進行5~10倍純化濃縮，在濃縮至終體積后，采用不同的洗濾體積進行三次洗濾，其中，第一次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的5-10倍，第二次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的2-5倍，第三次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的1-2倍；所述洗濾液為濃度0.1-0.15mol/l、ph?7.3-7.4的pbs。
28、經上述純化濃縮的病毒液依據濃縮倍數不同，毒價得到不同程度的提升（例如濃縮5倍的病毒液的毒價提升0.5個滴度，濃縮10倍的病毒液的毒價提升1個滴度），雜蛋白去除率可達90%以上。
29、本專利技術還提供采用上述方法制得的牛副流感病毒3型濃縮病毒液。
30、本專利技術的有益效果至少包括：本專利技術提供的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法針對懸浮培養的牛副流感病毒3型病毒液，能夠有效去除雜蛋白（雜蛋白去除率達到90%以上），且具有較高的病毒回收率，能夠顯著提高病毒液的毒價，制得濃縮病毒液的雜蛋白含量大幅度降低，同時與三次大體積洗濾相比，可有效節省洗濾時間，作為免疫原制備的疫苗免疫動物后無局部及全身不良反應，具有較好的免疫原性。
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1.一種牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述方法包括：將牛副流感病毒3型的病毒液采用中空纖維柱進行純化濃縮；
2.根據權利要求1所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，第一次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的5-6倍，第二次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的2-3倍，第三次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的1-1.5倍；
3.根據權利要求1或2所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述洗濾液為PBS；
4.根據權利要求3所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述PBS的pH為7.3-7.4。
5.根據權利要求1~4任一項所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述中空纖維柱的截留分子量為500-750KD。
6.根據權利要求1~5任一項所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述純化濃縮的濃縮倍數為5-10倍。
7.根據權利要求1~6任一項所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述病毒液為經懸浮培養獲得的病毒液。
8.根據權利
9.根據權利要求7或8所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述方法還包括：在純化濃縮前，先將經懸浮培養獲得的病毒液進行澄清處理。
10.根據權利要求9所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述澄清處理為將經懸浮培養獲得的病毒液進行離心。
...【技術特征摘要】
1.一種牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述方法包括：將牛副流感病毒3型的病毒液采用中空纖維柱進行純化濃縮；
2.根據權利要求1所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，第一次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的5-6倍，第二次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的2-3倍，第三次洗濾使用的洗濾液體積為濃縮體積的1-1.5倍；
3.根據權利要求1或2所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述洗濾液為pbs；
4.根據權利要求3所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述pbs的ph為7.3-7.4。
5.根據權利要求1~4任一項所述的牛副流感病毒3型的純化濃縮方法，其特征在于，所述中空纖維柱的截留分子量為500-750kd。...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳堅，賀瑤，張靜，張成，宋志剛，泰鵬，俎紅麗，孫慧，王娥娥，任建孚，胡麗紅，康健，王華，趙明治，關平原，
申請(專利權)人：金宇保靈生物藥品有限公司，
類型：發明
國別省市：
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