【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及植物基因工程，具體涉及一種從植物組織中分離原生質體的方法和質粒轉化方法。
技術介紹
1、番茄(solanum?lycopersicum?l.)是茄科茄屬的草本植物，番茄含有豐富的胡蘿卜素、維生素c和b族維生素，營養價值高，既可作為蔬菜也可作為水果，既可生食也可熟食。番茄作為一種重要的農作物，它不僅在飲食中占有重要地位，還在植物科學研究中具有重要價值。2012年，番茄品種“heinz1706”(亨氏1706)基因組測序完成(sato?et?al.nature2012)，這是番茄研究的一個重要里程碑，為后續的基因功能分析和遺傳改良奠定了基礎。自基因組測序以來，已經有近千個番茄種質資源進行了基因分型，這有助于了解番茄的遺傳多樣性和選擇有益的遺傳變異。目前對與番茄的研究主要集中在番茄果實的大小、果實的風味以及番茄抗病性等方面，如番茄的solyc10g079240基因編碼一個包含iq67結構域的蛋白，該基因通過增加果實縱向細胞的數量并減少橫向細胞數量來調控果實的伸長。盡管番茄是一年生植物，但其基因功能分析仍面臨挑戰，如傳統轉基因手段需要較長的時間周期，并且受到環境因素的影響。番茄作為一種模式植物和重要的農作物，其研究不僅有助于提高農業生產效率，還有助于推動植物科學和遺傳學的發展。通過不斷的研究和改良，可以為消費者提供更健康、更美味的番茄產品。
2、原生質體是去除細胞壁后的植物或微生物細胞，由細胞膜包圍，包含所有的細胞器和細胞質。它們是全能細胞，擁有各自物種的全部遺傳信息，它們可以執行各自組織的代謝活動，最重要的是
3、原生質體的瞬時表達技術為植物科學研究提供了一個強大的平臺，使得研究人員能夠在細胞水平上快速、高效地研究基因和蛋白質的功能。對于番茄的功能研究，高效獲得番茄葉片原生質體數量、提高瞬時轉化效率以及增長原生質體存活率，為番茄的遺傳學、生理學和分子生物學研究提供強有力的實驗支持具有十分重要的意義。
4、原生質體是通過酶促降解植物細胞壁獲得的，植物細胞去除細胞壁得到原生質體，沒有了細胞壁的保護，外源分子能夠更容易的通過轉化方法進入到細胞中去。但是如何能夠高效的將外源含有dna的質粒轉入原生質體中成為重要的限制因素，目前常用的獲取原生質體的方法存在嚴重的缺點，尤其是針對番茄葉片組織，獲得原生質體的過程繁瑣，獲得的數量相對較少；目前常用將原生質體與peg/ca2+溶液和mmg溶液孵育轉化存在較大的缺陷，轉化孵育時間長，受細胞狀態影響大，并且表現出不同生物學重復的表達水平的較高變異，轉化效率低。這是因為傳統的方法使用的mmg溶液中含有甘露醇：首先，甘露醇只能維持細胞的滲透壓，但不能提供原生質體漂浮在溶液表面的足夠平衡密度，隨著時間的推移，這阻止了原生質體所需的氣體交換，并導致于溶液底部的細胞處于窒息狀態，并嚴重限制了原生質體的壽命，一般不超過12-18小時，從而嚴重限制了實驗選擇，根本不允許表達時間較長的綜合性實驗開展；其次，且使用含甘露醇/山梨糖醇的培養基(mmg培養基)的方法分離獲得的原生質體，活的原生質體細胞與死的原生質體細胞混合在一起，需要通過繁瑣的活性檢測步驟，且純化和隨后的孵育步驟依舊還含有大量死細胞和細胞碎片，這些死細胞和細胞碎片阻礙了轉化并干擾了后續分析，并直接嚴重的影響接下來的質粒轉化效率；最后，含有甘露醇/山梨糖醇的培養基不能為細胞提供能量來源，這對于原生質體和來自非光合活性組織(如根、愈傷組織和懸浮培養細胞)的基于原生質體的實驗尤為重要，這也導致了轉化后的原生質體壽命更短，影響綜合實驗的開展。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是為了克服現有技術存在的分離過程繁瑣，效率低、分離出的原生質體壽命短問題，提供一種從植物組織中分離原生質體的方法，該方法具有過程簡單，效率高，分離出的原生質體壽命長的優點。
2、為了實現上述目的，本專利技術一方面提供一種從植物組織中分離原生質體的方法，包括：
3、將植物組織去除下表皮，置于tde-1酶解液中，黑暗環境下酶解，得到酶解液；
4、其中，所述tde-1酶解液包括纖維素酶r-10、離析酶r-10、bsa溶液、amp和pmc培養液；所述pmc培養液包括b5鹽、mes、二水氯化鈣、硝酸銨、蔗糖和氫氧化鉀溶液，所述pmc培養液中蔗糖的濃度為130g/l-140g/l；
5、將所述酶解細胞懸液離心，棄去下清液，得到原生質體。
6、優選地，所述酶解的時間不小于3h。
7、優選地，所述tde-1酶解液包括1.25％纖維素酶r-10、0.3％離析酶r-10、10％bsa溶液、100mg/ml?amp、余量的pmc培養液。
8、優選地，所述pmc培養液包括3.05g/l?b5鹽、0.5g/l?mes、0.75g/l二水氯化鈣、0.25g/l硝酸銨、130g/l-140g/l蔗糖，5m氫氧化鉀溶液。
9、優選地，所述pmc培養液的ph值為5.5-5.9。
10、優選地，所述植物組織包括番茄葉，在去除下表皮之前，還包括：
11、將番茄葉進行明暗16/8循環生長的20-30天。
12、本專利技術第二方面提供一種質粒轉化方法，包括：
13、將原生質體用ptb電轉緩沖液洗滌2-3次，再次加入ptb電轉緩沖液，得到重懸液，其中，所述原生質體采用本專利技術第一方面所述的方法分離；
14、將含有dna質粒的ptb電轉緩沖液加入到所述重懸液中，采用電擊轉化法進行質粒轉化。
15、優選地，所述ptb電轉緩沖液包括：2.4g/lhepes、0.6g/l氯化鈣、6g/l氯化鉀、130g/l-140g/l蔗糖，5m氫氧化鉀溶液。
16、優選地，所述ptb電轉緩沖液的ph值為6.9-7.4。
17、優選地，使用方波脈沖進行所述電擊轉化法。
18、優選地，所述方波脈沖的電壓為140v本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種從植物組織中分離原生質體的方法，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的時間不小于3h。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述TDE-1酶解液包括1.25％纖維素酶R-10、0.3％離析酶R-10、10％BSA溶液、100mg/ml?AMP、余量的PMC培養液，和/或，
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述植物組織包括番茄葉，在去除下表皮之前，還包括：
5.一種質粒轉化方法，其特征在于，包括：
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述PTB電轉緩沖液包括：2.4g/LHEPES、0.6g/L氯化鈣、6g/L氯化鉀、130g/L-140g/L蔗糖，5M氫氧化鉀溶液調節pH；和/或，
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，使用方波脈沖進行所述電擊轉化法。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述方波脈沖的電壓為140V-160V；
9.根據權利要求5-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述含有DNA質粒
10.根據權利要求5-8中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟采用電擊轉化法進行質粒轉化之后，還包括：
...【技術特征摘要】
1.一種從植物組織中分離原生質體的方法，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的時間不小于3h。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述tde-1酶解液包括1.25％纖維素酶r-10、0.3％離析酶r-10、10％bsa溶液、100mg/ml?amp、余量的pmc培養液，和/或，
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述植物組織包括番茄葉，在去除下表皮之前，還包括：
5.一種質粒轉化方法，其特征在于，包括：
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述ptb電轉緩沖液包括：2....
【專利技術屬性】
技術研發人員：邵曉宇，李黃金子，姚文宇，黃靖婷，皮特·普魯姆，
申請(專利權)人：南方科技大學，
類型：發明
國別省市：
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