【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物，具體涉及一種表達orfv截短f1l蛋白的重組載體、菌株及其應用。
技術介紹
1、羊口瘡(orf)，又稱羊傳染性膿皰(contagiousecthyma，ce)，是羊口瘡病毒(orfvirus，orfv)引起的一種人獸共患病。羊口瘡被我國列為b類動物傳染病，羊感染后可見口唇部、尾根部和乳房出現(xiàn)膿皰、潰爛和結節(jié)等典型癥狀。orf多發(fā)于秋冬季節(jié)，具有較強傳染性，傳播速度快，且不同品種均可感染。該病對羔羊的危害最大，可造成羔羊的死亡。由于病毒的抵抗力較強，該病一旦流行，流行區(qū)域很難徹底清除病原，這不僅危害我國畜牧業(yè)發(fā)展，造成巨大經濟損失，還直接威脅著人類的健康和公共衛(wèi)生安全。所以，開發(fā)出安全、有效的orf疫苗意義重大。
2、目前關于orf的報道多數(shù)集中于疫病診斷、藥物防控和病原學研究等方面，在可用于臨床的安全、有效的疫苗產品方面仍然不足。已知獲得獸藥產品批準文號的僅有1種羊傳染性膿皰皮炎活疫苗，尚無其他類型疫苗產品。傳統(tǒng)疫苗主要包括滅活疫苗和減毒活疫苗。減毒活疫苗具有成本低、免疫效果好的優(yōu)點，但有的微生物不易致弱，或致弱后易引起毒力返強，存在安全風險。滅活疫苗雖無毒力返強的風險，但制備成本較高、免疫效果相對較差，有的微生物制備成滅活疫苗甚至無免疫保護作用。核酸疫苗是指用含有編碼抗原基因序列的重組質粒作為疫苗，直接導入動物細胞內，借助宿主細胞的轉錄系統(tǒng)合成抗原，誘導宿主產生針對該抗原的免疫應答。但核酸疫苗長期在體內表達，可能會誘導機體產生免疫耐受現(xiàn)象，最終導致機體免疫抑制；持續(xù)的表達外源抗原可能激起機體
3、近年來，重組活載體疫苗已成為研究熱點。其克服了常規(guī)疫苗的缺點，兼有滅活疫苗和減毒疫苗的優(yōu)點。基因工程重組活載體疫苗是一種應用基因工程技術使用非致病性微生物作為載體來表達和傳遞異源抗原的新型疫苗。該類疫苗免疫動物向宿主免疫系統(tǒng)提交免疫原性蛋白的方式接近自然感染時的真實情況，從而可誘導產生更為廣泛的免疫，包括細胞免疫和體液免疫，甚至黏膜免疫，因此能夠克服重組亞單位疫苗的許多缺點。活載體疫苗具有免疫效力高、生產成本低及安全性能好等優(yōu)點，同時兼有常規(guī)活疫苗和滅活疫苗的優(yōu)點。
4、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae,s.cerevisiae)廣泛應用于食品工業(yè)，具有翻譯后修飾的過程，其細胞壁的表面成分β-1,3-d-葡聚糖和甘露聚糖具有很強的佐劑功能。釀酒酵母遺傳背景清晰，基因水平的改造可操作性強，并且具有生長速率快、對抑制劑耐受性強等優(yōu)勢，被公認為是最安全的酵母菌制劑。作為真核-生物的酵母，它的展示系統(tǒng)與以前常用的大腸桿菌以及噬菌體是不一樣的，它具有多肽翻譯后修飾所需的細胞器和酶，這樣用酵母展示的抗原蛋白將接近其天然構象，免疫原性較佳。因此，食品級釀酒酵母表面展示系統(tǒng)非常適合用于口服疫苗的開發(fā)。
5、現(xiàn)有技術中，部分專利或文獻資料對羊口瘡疫苗進行了報道。比如，cn118561965a專利公開了一種基于羊口瘡病毒f1l基因的mrna疫苗，該專利技術基于密碼子簡并性并對序列進行優(yōu)化，將羊口瘡病毒的f1l蛋白的編碼序列進行優(yōu)化，構建獲得羊口瘡病毒的mrna疫苗。又如，cn114807225a專利公開了一種抗羊口瘡和綿羊痘的重組dna疫苗及其重組質粒，該專利技術選擇羊口瘡病毒b2l(011)基因與綿羊痘病毒p32基因，用自剪切肽p2a將兩個基因串聯(lián)，自剪切肽p2a在真核細胞內發(fā)生自剪切，使兩個抗原蛋白在真核表達載體pcdna3.1(+)上獨立表達；該重組dna疫苗在免疫小鼠后具有較好的免疫效果。
6、目前未見基于釀酒酵母的orf重組活載體疫苗的報道。
技術實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術提供了一種表達羊口瘡病毒截短f1l蛋白的重組載體、重組酵母菌株、疫苗遞送系統(tǒng)及其應用。本專利技術通過構建表達羊口瘡病毒截短f1l基因的重組載體，并將其展示于釀酒酵母表面，所得重組酵母菌株具有較好的免疫原性。本專利技術為orfv疫苗研發(fā)提供了新思路。
2、本專利技術的目的之一在于提供一種表達羊口瘡病毒截短f1l基因的重組載體。
3、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術采用以下技術方案：
4、表達羊口瘡病毒截短f1l基因的重組載體，所述重組載體包含羊口瘡病毒截短f1l基因，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
5、f1l基因是orfv第59個完整開放閱讀框，編碼39kd蛋白，是病毒表面的微管組成成分之一。其具有良好的免疫原性，可誘導機體產生中和抗體，可作為orf疫苗開發(fā)的候選抗原之一。f1l基因編碼的aa15-aa191片段，抗原性較強，親水性好，無跨膜結構域。本專利技術將orfv的f1l基因截短，并展示于釀酒酵母表面，具有免疫原性好、降解風險低的優(yōu)勢，有助于后續(xù)orfv口服疫苗的研制。
6、進一步，截短的f1l基因序列引入his標簽和終止密碼子序列，其如seq?id?no.2所示。
7、進一步，所述羊口瘡病毒截短f1l基因的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
8、進一步，所述重組載體中還包含質粒載體，所述質粒載體為pyd1質粒。
9、進一步，所述重組載體的鑒定引物包括正向引物orf-f和反向引物orf-r，所述orf-f的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，所述orf-r的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。
10、本專利技術的目的之二在于提供一種含有前述重組載體的重組酵母菌株。
11、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術采用以下技術方案：
12、含有前述重組載體的重組酵母菌株。
13、進一步，所述重組酵母菌株是將所述重組載體導入釀酒酵母感受態(tài)細胞中而獲得。
14、作為優(yōu)選，所述釀酒酵母感受態(tài)細胞為eby100感受態(tài)細胞。
15、作為優(yōu)選的方案，所述重組酵母菌株的制備方法如下：
16、將羊口瘡病毒的f1l基因截短，引入his標簽和終止密碼子序列后，構建到pyd1質粒中，純化得到pyd1-f1l重組質粒；將所述pyd1-f1l重組質粒導入釀酒酵母感受態(tài)細胞中，獲得重組酵母菌株。
17、本專利技術的目的之三在于提供一種羊口瘡病毒截短f1l蛋白的疫苗遞送系統(tǒng)。
18、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術采用以下技術方案：
19、羊口瘡病毒截短f1l蛋白的疫苗遞送系統(tǒng)，所述疫苗遞送系統(tǒng)包括遞送載體和目的基因；所述遞送載體為釀酒酵母，所述目的基因為引入his標簽和終止密碼子序列的羊口瘡病毒截短f1l基因；所述羊口瘡病毒截短f1l基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述his標簽和終止密碼子的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述目的基因展示于釀酒酵母表面。
20、本專利技術的目的之四于提供一種orfv口服疫苗。
21、本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.表達羊口瘡病毒截短F1L基因的重組載體，其特征在于，所述重組載體包含羊口瘡病毒截短F1L基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.根據權利要求1所述的重組載體，其特征在于，截短的F1L基因序列引入His標簽和終止密碼子序列，其如SEQ?ID?NO.2所示。
3.根據權利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述羊口瘡病毒截短F1L基因的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
4.根據權利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體中還包含質粒載體，所述質粒載體為pYD1質粒。
5.根據權利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體的鑒定引物包括正向引物orf-F和反向引物orf-R，所述orf-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，所述orf-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。
6.含有權利要求1～5任一項所述的重組載體的重組酵母菌株。
7.根據權利權利要求6所述的重組酵母菌株，其特征在于，所述重組酵母菌株是將所述重組載體導入釀酒酵母感受態(tài)細胞中而獲得。
8.羊
9.OrfV口服疫苗，其特征在于，所述OrfV口服疫苗含有權利要求1～5任一項所述的重組載體、權利要求6～7任一項所述的重組酵母菌株和/或權利要求8所述的疫苗遞送系統(tǒng)。
10.權利要求1～5任一項所述的重組載體、權利要求6～7任一項所述的重組酵母菌株和/或權利要求8所述的疫苗遞送系統(tǒng)在制備用于預防羊口瘡病毒感染的疫苗和/或治療羊口瘡的藥物中的應用。
...【技術特征摘要】
1.表達羊口瘡病毒截短f1l基因的重組載體，其特征在于，所述重組載體包含羊口瘡病毒截短f1l基因，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.根據權利要求1所述的重組載體，其特征在于，截短的f1l基因序列引入his標簽和終止密碼子序列，其如seq?id?no.2所示。
3.根據權利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述羊口瘡病毒截短f1l基因的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
4.根據權利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體中還包含質粒載體，所述質粒載體為pyd1質粒。
5.根據權利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體的鑒定引物包括正向引物orf-f和反向引物orf-r，所述orf-f的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，所述orf-r的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。
6.含有權利要求1～5任一項所述的重組載體的重組酵母菌株。
7.根...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：許國洋，付利芝，余遠迪，楊柳，沈克飛，高廣亮，張大妹，鄭華，牟豪，李紹梅，羅杰，
申請(專利權)人：重慶市畜牧科學院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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