【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及三陰性乳腺癌，具體涉及一種驗證circmkln1對tnbc細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法。
技術介紹
1、在世界范圍內，乳腺癌是發病率最高的女性惡性腫瘤，且其發病率在逐年攀升，嚴重威脅著女性的生命健康。根據病理學的診斷結果，乳腺癌可以分為不同的亞型，其中三陰性乳腺癌(triple?negative?breast?cancers,tnbc)是侵襲性最強的乳腺癌亞型之一，其具有生長速度快、轉移時間早、復發率高以及缺乏有效的診療靶點等特點，因此tnbc患者的預后相較于其他乳腺癌類型較差。因此深入研究tnbc發生發展的分子機制，將有助于尋找tnbc早期診斷、預后生物標志物和治療靶點，對于提升tnbc患者治療效果、改善生存預后情況具有重要意義。
2、環狀rna(circular?rna，circrna)是由前體mrna經反向剪接形成的共價閉合環形rna。其結構穩定、含量豐富、組織特異性表達，在癌癥的診斷、預后和治療中具有重要價值。據報道，circrna有多種生物學功能，包括作用microrna“海綿”、與rna結合蛋白相互作用、調節基因轉錄等，circrna因其獨特的結構和多種生物學功能成為近年來的研究熱點。近年circrna在惡性腫瘤的增殖、轉移、凋亡、侵襲等多個過程中的重要生物學功能受到了研究者的廣泛關注。因此，以circrna為切入點闡明tnbc發生發展的分子機制，有望為tnbc的診療開辟新的途徑。
3、為了尋找與tnbc發生發展密切相關的circrnas，利用環狀rna?qpcr芯片，
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術的目的在于提供了一種驗證circmkln1對tnbc細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法。
2、為了實現上述目的，本專利技術提供了如下技術方案：
3、一種驗證circmkln1對tnbc細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法，該方法包括如下試驗：
4、1)sirna轉染和敲低效率驗證實驗；
5、2)cck-8實驗；
6、3)2edu實驗；
7、4)克隆形成實驗；
8、5)劃痕實驗；
9、6)transwell實驗。
10、進一步地，步驟1)sirna轉染和敲低效率驗證實驗的步驟如下：
11、(1)在轉染前一天將細胞常規消化后離心，可進行細胞計數，根據轉染和后續實驗所需進行細胞鋪板；
12、(2)轉染前棄去細胞的原培養基，用pbs輕柔沖洗細胞2遍后加入無血清培養基(12孔板中加入1ml培養基，其他培養皿/培養孔板根據底面積計算所需培養基的體積)；
13、(3)在生物安全柜內取出無菌的ep管，每個sirna準備兩個ep管，向每個ep管中加入150ul無血清培養基；
14、(4)向其中一個ep管中加入lipofectamine?3000，輕彈管壁或上下顛倒使混勻；再向另外一個ep管中加入所需量的sirna，輕彈管壁或上下顛倒使混勻；
15、(5)將裝有sirna的ep管逐滴加入到裝有lipofectamine?3000的ep管中，顛倒混勻后室溫靜置15min；
16、(6)置于37℃培養孵箱中孵育，6-8h后棄培養基，換成完全培養基繼續培養48h后進行后續實驗；
17、(7)48h后，提取細胞rna，逆轉錄后通過rt-qpcr測定sirna敲低circmkln1的效率。
18、進一步地，步驟2)cck-8實驗的步驟如下：
19、(1)消化、離心并重懸已轉染的細胞，然后進行細胞計數；
20、(2)取潔凈的經高壓滅菌的離心管，加入一定量的培養基，然后將所需體積的細胞懸液加至培養中；
21、(3)用移液器將細胞懸液吹打混勻，吸取100μl細胞懸液加入96孔透明細胞培養板中，接種密度為1500-2000個細胞每孔，設置6個復孔；在96孔板的最外側一圈每孔加入100μlpbs，以減少細胞培養基的液體揮發產生的邊緣效應；每種細胞均進行4天的連續檢測；
22、(4)將細胞置于培養箱種分別培養4天，每天在同一時間取出一個96孔板，每孔加入10μl?cck-8溶液后重新放入培養箱內，注意避光；
23、(5)2h后取出96孔板，去除96孔板的蓋子，用酶標儀檢測每孔在450nm處的吸光度值；
24、(6)收取4天的吸光度值后，繪制細胞的增殖曲線。
25、進一步地，步驟3)2edu實驗的步驟如下：
26、3.1)實驗自備試劑
27、 固定液 4％的多聚甲醛 洗滌液 1×pbs緩沖液 通透液 含0.3％triton?x-100的pbs
28、3.2)細胞的edu標記
29、(1)在6孔板中培養適量細胞；待細胞培養過夜且恢復到正常狀態后，進行轉染；
30、(2)用培養基1：500稀釋edu(10mm),得到2×edu工作液(20μm)；
31、(3)將37℃預熱的2×edu工作液，按與培養基相同體積加入6孔板中，使6孔板中的edu終濃度變為1×。放入培養箱中孵育5h；
32、(4)細胞的edu標記完成后，吸棄培養液，并加入1ml?4％多聚甲醛，室溫固定15min；
33、(5)去除固定液，每孔加入1ml?pbs洗滌細胞3次，每次5min；
34、(6)去除洗滌液，每孔加入1ml含0.3％triton?x-100的pbs，室溫孵育15min；
35、(7)去除通透液，每孔用1mlpbs洗滌細胞2次，每次5min；
36、3.3)edu檢測
37、(1)用1.5ml去離子水溶解一管click?additive，混勻至全部溶解，即為clickadditive?solution；
38、(2)配置click反應液：按順序依次向15ml離心管中加入4.3mlclick?reactionbuffer、200μlcuso4、10μl555?azide、500μl?click?additive?solution；
39、(3)去除上一步驟中的pbs；
40、(4)每孔加入0.5ml?click反應液，輕本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種驗證circMKLN1對TNBC細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法，其特征在于，該方法包括如下試驗：
2.權利要求1所述的一種驗證circMKLN1對TNBC細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法，步驟1)siRNA轉染和敲低效率驗證實驗步驟如下：
3.權利要求1所述的一種驗證circMKLN1對TNBC細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法，其特征在于，步驟2)CCK-8實驗的步驟如下：
4.根據權利要求1所述一種驗證circMKLN1對TNBC細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法，其特征在于，步驟3)2EDU實驗的步驟如下：
5.根據權利要求1所述的一種驗證circMKLN1對TNBC細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法，其特征在于，步驟4)克隆形成實驗的實驗步驟如下：
6.根據權利要求1所述的一種驗證circMKLN1對TNBC細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法，其特征在于：步驟5)劃痕實驗的實驗步驟如下：
7.根據權利要求1所述的一種驗證circMKLN1對TNBC細胞增殖、遷移及
...【技術特征摘要】
1.一種驗證circmkln1對tnbc細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法，其特征在于，該方法包括如下試驗：
2.權利要求1所述的一種驗證circmkln1對tnbc細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法，步驟1)sirna轉染和敲低效率驗證實驗步驟如下：
3.權利要求1所述的一種驗證circmkln1對tnbc細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法，其特征在于，步驟2)cck-8實驗的步驟如下：
4.根據權利要求1所述一種驗證circmkln1對tnbc細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的試驗方法...
【專利技術屬性】
技術研發人員：林紅，高余翟，李麗仙，陳萬一，李巧巧，余清華，
申請(專利權)人：重慶大學附屬腫瘤醫院，
類型：發明
國別省市：
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