【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于醫藥，具體涉及用于遞送mrna的腦靶向脂質體及其制備方法和應用。
技術介紹
1、腦部疾病種類繁多，涵蓋了從急性到慢性的各種病理狀態，而且其復雜性和多樣性給預防、診斷和治療帶來了極大的困難。它主要包括腦腫瘤、神經退行性疾病、腦萎縮、腦血管相關疾病等。其中較為嚴峻的tau?蛋白病占?20?多種神經退行性疾病，包括阿爾茨海默病（ad）、額顳葉癡呆（ftd）、皮質基底節變性（cbd）等，其病理學鑒定為不溶性?tau?蛋白的細胞內神經原纖維纏結。隨著生物技術和分子生物學的不斷進步，最近在藥物開發方面取得了進展，但由于對腦組織的主要屏障了解較少，使得分子難以到達大腦，因此腦部疾病治療的成功率仍然很低。
2、mrna（信使核糖核酸）技術因其在?covid-19?疫苗開發中的開創性應用而獲得2023?年諾貝爾獎的認可。這項技術在神經退行性疾病治療領域的應用是一個新興且充滿潛力的研究方向。mrna可以編碼特定的蛋白質，從而實現對疾病相關靶點的精準靶向。在腦部疾病中，這有助于減少對傳統藥物的副作用，提高治療效果。這對于治療腦部疾病至關重要，因為這些疾病往往與特定蛋白質的缺失或功能異常有關。同時，mrna技術允許快速設計和合成針對不同疾病的mrna，這使得它在應對新興疾病或病毒變種時具有獨特的優勢。目前針對mrna遞送的最主要載體是脂質納米顆粒。例如，遞送mrna實現covid-19疫苗的技術是近年來疫苗開發的重要突破。這種技術利用了mrna作為遺傳信息載體的特性，通過將編碼病毒抗原的mrna遞送到人體細胞內，從而激發免疫系
3、文獻報道（zhang,?zi-yang,?et?al.?"trim11?protects?against?tauopathiesand?is?down-regulated?in?alzheimer’sdisease."?science?381.6656?(2023):eadd6696.），trim11蛋白被發現可以抑制類似于阿爾茨海默?。╝d）的tau蛋白相關疾病的惡化，并改善認知和運動能力。它們是tau蛋白與蛋白酶體之間的重要聯系。在阿爾茨海默病患者大腦中，trim11蛋白水平顯著降低，恢復其表達可能具有潛在治療益處。trim11通過促進突變型和野生型tau蛋白的降解、防止tau蛋白錯誤折疊和聚集、以及分解已經形成的tau蛋白聚集體來發揮作用。因此，對于tau蛋白相關疾病，trim11是一個有潛力的靶點。
4、盡管mrna在腦部疾病治療中展現出巨大的潛力，但仍面臨諸多挑戰。首先，血腦屏障的存在使得系統性給藥難以被遞送到大腦中的神經元。為了克服這一障礙，研究人員正在開發各種新型遞送系統，如病毒載體、脂質納米顆粒、細胞外囊泡等。其次，mrna的不穩定性和缺乏腫瘤靶向性也是制約其在腦部疾病治療中應用的重要因素。因此，開發穩定、高效、具有靶向性的mrna遞送系統是當前研究的重點。
技術實現思路
1、本專利技術為了解決目前穿透血腦屏障（bbb）能力差、包封效率低和穩定性差的局限性，我們構建了用于遞送mrna的腦靶向脂質體遞送系統（plnp-mrna），它通過乙酰膽堿（nachrs）和煙堿受體（chts）促進?bbb?穿透，同時調控mrna的高表達，進而精準遞送mrna靶向腦部，實現腦類疾病的安全有效治療和預防。
2、本專利技術具體采用以下技術方案：
3、本專利技術首先提供了用于遞送mrna的腦靶向脂質體，該脂質體采用以下方法制備得到：
4、步驟1：合成pmpc-cpadn：以偶氮二異丁腈為引發劑，采用4-氰基-4（苯基硫代甲酰硫基）戊酸和2-（甲基丙烯酰氧基）乙基-2-（三甲基氨基）乙基磷酸酯反應得到pmpc-cpadn；本步驟反應在超干甲醇中進行，反應時真空凍融除氧，反應溫度70?℃，攪拌轉數600?rpm，反應時間24?h。
5、步驟2：合成dspe-pmpc：用n-羥基琥珀酰亞胺和n,n?-二環己基碳二亞胺活化pmpc-cpadn的羧酸官能團，然后加入1,2-二硬脂?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺、三乙胺反應得到dspe-pmpc。本步驟中的活化在超干甲醇中進行，室溫反應24?h?；罨髮?,2-二硬脂?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺溶解在超干dmf中，然后加入活化后的反應液中繼續反應，同時加入三乙胺，40℃反應24?h。
6、步驟3：plnp的制備：取原料sm-102、dspc、膽固醇、dmg-peg、dspe-pmpc的母液混合配制得到脂質體溶液，其中，sm-102、dspc、膽固醇、dspe-pmpc、dmg-peg的摩爾比為50：5：38.5：5～7.5：1.5～3，優選為50：5：38.5：5：1.5。
7、上述的脂質體可應用于制備脂質體/mrna（靶基因為trim１１）復合物，該脂質體/mrna復合物可用于制備治療腦類疾病的藥物。具體的，將上述制備得到的脂質體溶液和mrna溶液混合，最終制備得到脂質體/mrna，命名為plnp/mrna。其中所述腦類疾病為tau蛋白相關腦類疾病，具體為阿爾茨海默癥。用于治療阿爾茨海默癥時，所述mrna為humantrim11?mrna，其堿基序列如seq?id?no:1所示。制備脂質體/mrna時，所述脂質體溶液的濃度為8mm，所述mrna溶液是將mrna溶于配制好的ph=4的檸檬酸緩沖液中得到，其終濃度為0.054μg/μl，混合時脂質體溶液和mrna溶液的體積比為1:3。
8、因此，本專利技術還提供了上述用于遞送mrna的腦靶向脂質體或plnp-mrna在制備治療腦類疾病藥物中的應用。
9、本專利技術的有益效果為：
10、本專利技術的用于遞送mrna的腦靶向脂質體，其物理化學性質穩定，有效保護mrna免受核酸酶降解，能夠裝載mrna遞送至腦部。該plnp-mrna具有以下優勢：
11、（1）pmpc-dspe有利于脂質納米顆粒?mrna?疫苗高效穿越血腦屏障bbb，擁有卓越的腦靶向能力以及轉染能力；
12、（2）plnp-mrna具有生物可降解性，良好的生物相容性，安全無毒，同時集治療和預防效果于一體，具有強大的抗腦類疾病的活性。這些優勢為mrna疫苗的臨床轉化提供了重要的參考意義及價值。
13、（3）在具體實施例中，通過尾靜脈注射plnp-mtrim11到小鼠體內，可上調trim11mrna的表達，快速翻譯為蛋白質，最大可能避免脫靶效應，進而溶解預先存在的tau?蛋白纏結和異常磷酸化的tau?蛋白，同時減輕神經炎癥的發生，保護和修復神經元，從而提高小鼠的學習和認知能力；?trim11?mrna?促進磷酸化?tau?的降解和過量?tau?蛋白聚集體的清除，是?tau?蛋白與蛋白酶體之間的重要連接。trim11還可以改善神經炎癥和炎癥因子的侵襲，保護神經元免受損傷，起到預防和保護的阿爾茨海默癥的學習和認知能力。
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1.用于遞送mRNA的腦靶向脂質體，其特征在于，采用以下方法制備得到：
2.根據權利要求1所述的用于遞送mRNA的腦靶向脂質體，其特征在于，步驟（1）中反應在超干甲醇中進行，反應時真空凍融除氧，反應溫度70?℃，攪拌下反應24?h。
3.根據權利要求1所述的用于遞送mRNA的腦靶向脂質體，其特征在于，步驟（2）中的活化在超干甲醇中進行，室溫反應24?h。
4.根據權利要求1所述的用于遞送mRNA的腦靶向脂質體，其特征在于，步驟（2）中，活化后將1,2-二硬脂?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺溶解在超干DMF中，然后加入活化后的反應液中繼續反應，同時加入三乙胺，40℃反應24?h。
5.根據權利要求1所述的用于遞送mRNA的腦靶向脂質體，其特征在于，步驟（3）中SM-102、DSPC、膽固醇、DSPE-PMPC、DMG-PEG的摩爾比為50：5：38.5：5～7.5：1.5～3。
6.權利要求1～5任一項所述的用于遞送mRNA的腦靶向脂質體在制備脂質體/mRNA復合物中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述脂質體溶液的濃度為8mM，所述mRNA溶液是將mRNA溶于配制好的pH=4的檸檬酸緩沖液中得到，其終濃度為0.054?μg/μL，脂質體溶液和mRNA溶液混合時脂質體溶液和mRNA溶液的體積比為1:3。
9.權利要求1～5任一項所述的用于遞送mRNA的腦靶向脂質體或權利要求6所述的脂質體/mRNA在制備及治療腦類疾病中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述腦類疾病為Tau蛋白相關腦類疾病。
...【技術特征摘要】
1.用于遞送mrna的腦靶向脂質體，其特征在于，采用以下方法制備得到：
2.根據權利要求1所述的用于遞送mrna的腦靶向脂質體，其特征在于，步驟（1）中反應在超干甲醇中進行，反應時真空凍融除氧，反應溫度70?℃，攪拌下反應24?h。
3.根據權利要求1所述的用于遞送mrna的腦靶向脂質體，其特征在于，步驟（2）中的活化在超干甲醇中進行，室溫反應24?h。
4.根據權利要求1所述的用于遞送mrna的腦靶向脂質體，其特征在于，步驟（2）中，活化后將1,2-二硬脂?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺溶解在超干dmf中，然后加入活化后的反應液中繼續反應，同時加入三乙胺，40℃反應24?h。
5.根據權利要求1所述的用于遞送mrna的腦靶向脂質體，其特征在于，步驟（3）中sm-102、dspc、膽固醇、dspe-pmpc、dmg-peg的摩爾比為50：5：3...
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