【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程，特別是涉及一種提高crispr/cas13d系統敲降rna效率的方法及其應用。
技術介紹
1、crispr/cas13d是從古細菌基因組數據庫中挖掘出的靶向rna的crispr系統。在crispr/cas13d系統中，grna與dr30_cas13d復合物結合并識別目標rna時，能夠激活cas13d蛋白對靶向rna的rnase活性，切割靶rna。10-23dnazyme是一種通過體外選擇出來的人造dnazyme，可對靶rna進行切割，僅含有約30個脫氧核苷酸，因此易于合成以及加入其他系統中進行應用。10-23dnazyme系統中，其結構由兩側的識別臂和一個環狀的催化結構域構成，通過設計兩側識別臂來識別靶rna進行切割。
2、近幾年，crispr/cas13d系統已被應用于多種基礎研究上，同時crispr/cas13d系統還具有廣泛的應用前景。現有的cas13d蛋白，如rfxcas13d因其活性高得到了廣泛的研究和應用，但是其對于部分rna的敲降效率僅有50％左右，對于rna研究及應用而言仍有待提高。為提高crispr/cas13系統的基因編輯效率，研究人員已在改造cas13d蛋白的結構等方面開展工作，但并沒有能夠顯著提高crispr/cas13d系統的敲降效率的技術方法。在針對高通量rna編輯時，需要從文庫的構建、高通量的編輯技術、文庫篩選等多方面共同協作，而高通量rna編輯的編輯效率難以提高的問題始終阻礙相關研究的開展。因此，開發一種提高crispr/cas13d系統敲降效率的方法，以提高r
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種提高crispr/cas13d系統敲降效率的技術方法。
2、本方法將10-23dnazyme連接至crispr/cas13d系統的grna上構建grna_dz13；利用grna_dz13構成的crispr/cas13d系統，能夠顯著提高對靶rna的敲降效率。
3、本專利技術提供如下技術方案：
4、一種提高crispr/cas13d系統敲降rna效率的方法，主要包括以下步驟：
5、步驟一：比較crispr/cas13d系統和10-23dnazyme系統切割rna的特征，根據兩個系統之間的特征：設計靶向目的rna的grna，將10-23dnazyme的一側識別臂的5’末端連接至grna的3’末端構建grna_dz13；
6、步驟二：合成grna_dz13的核苷酸序列，如下述seq?id?no.1所示；
7、nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnggctagctacaac?gannnnnnnnn(seqid?no.1)
8、步驟三：將合成的grna_dz13序列連接到載體pak_dr30_cas13d_mcherry上，即將合成的grna_dz13與載體上的bbsⅰ酶切位點的核苷酸序列進行替換，得到pak_dr30_grna_dz13_cas13d_mcherry質粒；
9、步驟四：轉化dh5α感受態大腸桿菌、挑取單克隆菌落、送公司測序，確定目標序列已正確構建到載體上，當測序結果與預期grna_dz13序列一致時，得到目標質粒；
10、步驟五：吸取1μl步驟四得到的目標質粒轉化進dh5α感受態大腸桿菌，涂板，37℃培養12h，挑菌單克隆至含500μl?lb液體培養基的1.5ml離心管中，37℃、220rpm培養6h，取150μl菌液于含有15ml?lb液體培養基的50ml離心管中，37℃、220rpm培養12h，提取pak_dr30_grna_dz13_cas13d_mcherry質粒。
11、其中，
12、(1)根據crispr/cas13d系統和10-23dnazyme系統切割rna的特征構建grna_dz13，如seq?id?no.1所示；
13、(2)將grna_dz13連接到載體pak_dr30_cas13d_mcherry上，即將合成的grna_dz13序列與載體上的bbsⅰ酶切位點的核苷酸序列進行替換，得到pak_dr30_grna_dz13_cas13d_mcherry質粒；
14、(3)將pak_dr30_grna_dz13_cas13d_mcherry質粒轉染進入易染細胞中，通過該質粒表達dr30_grna_dz13_cas13d復合體，發揮rna敲降功能；
15、(4)dr30_grna_dz13_cas13d復合體中：grna負責與靶rna進行堿基配對，若grna能夠與靶rna完成堿基配對，將會激活10-23dnazyme與cas13d對靶rna的rnase活性。
16、(5)dr30_grna_dz13_cas13d復合體中：若grna不能夠與靶rna完成堿基配對，rna會被dr30_grna_dz13_cas13d復合體釋放，不會激活10-23dnazyme與cas13d對靶rna的rnase活性；
17、dr30_grna_dz13_cas13d復合體會繼續與另一條rna進行堿基配對；
18、(6)dr30_grna_dz13_cas13d復合體中：10-23dnazyme負責在grna與靶rna完成堿基配對后，對靶rna進行切割；
19、(7)dr30_grna_dz13_cas13d復合體中：cas13d蛋白負責在grna與靶rna完成堿基配對后，對靶rna進行切割；
20、本專利技術dr30_grna_dz13_cas13d切割內源rna的具體步驟及檢測效率方法如下：
21、步驟(1)：將pak_dr30_grna_dz13_cas13d_mcherry質粒按照轉染試劑lipofectamine?2000的說明書劑量要求轉染至易染細胞中，所述易染細胞已在6-8小時前在十二孔板鋪勻，使得用于轉染時的易染細胞密度在70％-80％；
22、步驟(2)：在細胞培養箱內37℃5％co2培養，6h后更換不含抗生素的10％胎牛血清細胞培養液繼續培養，48h收取細胞；
23、步驟(3)：提取細胞rna，rt-qpcr檢測靶rna的量，確定dr30_grna_dz13_cas13d復合體的敲降效率。
24、本專利技術通過在crispr/cas13d系統的grna上添加輔助元件10-23dnazyme(dz13)，實現一種提高crispr/cas13d系統敲降rna效率的方法；本專利技術的實施例驗證其敲除效率至少可以達到71％～86％左右；且與傳統crispr/cas13d系統相比，可以使得敲除效率與傳統crispr/cas13d系統相比提高19％～28％以上，使用本方法能在哺乳動物細胞中顯著提高crispr/cas13d系統敲降rna效率，在基因編輯領域中具有廣泛的應用前景。
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1.一種用于提高CRISPR/Cas13d系統敲降RNA效率的gRNA_DZ13序列，其特征在于，所述gRNA_DZ13序列的核苷酸序列，如SEQ?ID?NO.1所示。
2.根據權利要求1所述gRNA_DZ13序列在提高CRISPR/Cas13d系統敲降RNA效率方面的應用。
3.一種提高CRISPR/Cas13d系統敲降RNA效率的方法，其特征在于，包括以下步驟：
【技術特征摘要】
1.一種用于提高crispr/cas13d系統敲降rna效率的grna_dz13序列，其特征在于，所述grna_dz13序列的核苷酸序列，如seq?id?no.1所示。
2.根據權利要...
【專利技術屬性】
技術研發人員：左波，阮興友，何春鵬，彭雅鑫，徐在言，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：
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