【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及癌細(xì)胞檢測(cè)，具體涉及一種基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面ptk7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、本專利技術(shù)
技術(shù)介紹
中公開的信息僅僅旨在增加對(duì)本專利技術(shù)的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
2、腫瘤目前是全球發(fā)病率和致死率較高的疾病之一，與心血管疾病并列，成為威脅人類健康的三大疾病之一。當(dāng)前針對(duì)腫瘤的主要治療方式包括手術(shù)、化療、免疫治療和靶向治療，手術(shù)是唯一可治愈的方式，但有很大部分病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移，徹底喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)。目前臨床上對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移情況的評(píng)估，主要依賴于b超檢查、ct掃描、核磁共振成像等，通常只能等出現(xiàn)較明顯腫瘤后才能被發(fā)現(xiàn)，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)已錯(cuò)過最佳治療時(shí)間。因此，需要發(fā)展一種新的評(píng)估腫瘤轉(zhuǎn)移的手段和方法，在早期腫瘤未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)，就能夠評(píng)估患者后續(xù)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的概率，采取提前干預(yù)的治療措施，這對(duì)于提高患者的治愈率，延長(zhǎng)生存期具有十分重要的意義。
3、單分子示蹤技術(shù)是指利用熒光蛋白、熒光染料或者納米顆粒對(duì)目標(biāo)分子特異性標(biāo)記后，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)追蹤熒光或者散射光信號(hào)，并輔以數(shù)據(jù)分析算法，使用擴(kuò)散系數(shù)等定量表征分子動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)的情況，目前已被廣泛應(yīng)用到材料、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究中。盡管單分子示蹤技術(shù)已得到了廣泛應(yīng)用，但是選擇合適的方法標(biāo)記細(xì)胞表面分子是該技術(shù)面臨的一個(gè)問題。熒光蛋白標(biāo)記是單分子示蹤中最常用的標(biāo)記方法，將熒光蛋白與目的蛋白基因進(jìn)行融合表達(dá)，使膜蛋白在表達(dá)時(shí)自帶熒光標(biāo)簽。盡管該方法對(duì)細(xì)胞活性影響較小，但是實(shí)驗(yàn)操作
4、因此，需要一種新的技術(shù)方案，實(shí)現(xiàn)在診斷出腫瘤組織后能夠更早、更快速有效地評(píng)估腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的治療效果，延長(zhǎng)生命周期。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了快速有效地評(píng)估腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，本專利技術(shù)提供一種基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面ptk7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：?jiǎn)畏肿邮聚櫉晒鈽?biāo)記探針、熒光顯微鏡、圖像采集模塊和圖像處理模塊。
2、所述單分子示蹤熒光標(biāo)記探針包括靶向ptk7的標(biāo)記單元和單分子示蹤熒光基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，所述標(biāo)記單元為靶向ptk7的核酸適體。在一些實(shí)施例中所述標(biāo)記單元為靶向ptk7的多肽。在一些實(shí)施例中，所述標(biāo)記單元為靶向ptk7的肽核酸。在一些實(shí)施例中，所述標(biāo)記單元為靶向ptk7的納米抗體。
3、優(yōu)選地，所述標(biāo)記單元為sgc8核酸適體，所述sgc8核酸適體能夠特異性識(shí)別并結(jié)合樣本細(xì)胞表面的ptk7分子。ptk7(protein?tyrosine?kinase?7)是缺乏催化活性的受體酪氨酸激酶。最初是在結(jié)直腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)上調(diào)，因此也被稱為結(jié)腸癌激酶-4(cck-4)。ptk7主要分布在細(xì)胞連接處以及細(xì)胞膜上，在細(xì)胞極化、增殖、遷移等生理過程中發(fā)揮了重要的作用。除了結(jié)直腸癌外，ptk7也被發(fā)現(xiàn)在其它多種腫瘤中表達(dá)異常，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食管癌和肝癌等，并與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及多項(xiàng)腫瘤病理指標(biāo)密切相關(guān)。而核酸適體是一段長(zhǎng)度大約為25-80個(gè)堿基的寡核苷酸，能夠與各類特定的靶標(biāo)結(jié)合。本專利技術(shù)所使用的sgc8核酸適體(序列及結(jié)構(gòu)如圖1所示)，能夠特異性識(shí)別并結(jié)合ptk7，由專利技術(shù)人課題組前期通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic?evolution?ofligands?by?exponential?enrichment,selex)篩選得出，該核酸適體對(duì)于膜蛋白ptk7具有的優(yōu)異的靶向性和特異性。
4、本專利技術(shù)將該分子量小、合成簡(jiǎn)單的sgc8核酸適體作為靶向單元，并偶聯(lián)單分子示蹤熒光基團(tuán)，構(gòu)建單分子示蹤探針。該探針靶向性好，對(duì)ptk7蛋白分子的結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)的干擾小，因此能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)異的原位、無干擾、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地追蹤ptk7蛋白的運(yùn)動(dòng)。
5、所述單分子示蹤熒光基團(tuán)為熒光染料，量子點(diǎn)及熒光蛋白。常見的熒光染料包括有機(jī)染料，如alexa?flour、cyanine、atto系列等不同波長(zhǎng)染料。
6、優(yōu)選地，所述單分子示蹤熒光基團(tuán)為atto647n，sgc8核酸適體偶聯(lián)量子效率高且光穩(wěn)定性好的熒光染料atto647n作為標(biāo)記探針使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠準(zhǔn)確。
7、進(jìn)一步地，所述單分子示蹤熒光標(biāo)記探針通過如下制備方法制得：將所述sgc8核酸適體的5’端通過n-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)偶聯(lián)熒光染料atto647n。
8、本專利使用的成像系統(tǒng)為單分子全內(nèi)反射熒光顯微鏡，包括精確實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射條件的電動(dòng)tirf模塊，以及能夠以固定間隔時(shí)間開啟以激發(fā)熒光的激光器。所述圖像采集模塊設(shè)置于所述熒光顯微鏡的前端攝像出口，用于采集并記錄單分子熒光信號(hào)，得到ptk7分子的運(yùn)動(dòng)軌跡。將樣本細(xì)胞與所述探針共同孵育后，在熒光顯微鏡下采用激光器間隔固定時(shí)間激發(fā)熒光，連續(xù)采集并記錄單分子熒光信號(hào)，得到ptk7分子的運(yùn)動(dòng)軌跡。進(jìn)一步地，所述固定間隔時(shí)間為100-300ms，所述圖像采集模塊連續(xù)記錄300幀以上的圖像。該間隔時(shí)間越小，幀數(shù)越高，得到的擴(kuò)散系數(shù)的計(jì)算數(shù)據(jù)越精準(zhǔn)。
9、所述視覺處理模塊用于對(duì)樣本細(xì)胞的每個(gè)ptk7分子作msd-t曲線(均方位移meansquare?displacement與時(shí)間t的關(guān)系曲線)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，通過均方位移(msd)對(duì)數(shù)與間隔時(shí)間(t)對(duì)數(shù)之間關(guān)系，計(jì)算各ptk7分子的擴(kuò)散系數(shù)，通過統(tǒng)計(jì)所有ptk7分子的擴(kuò)散系數(shù)，得到樣本細(xì)胞表面ptk7分子的擴(kuò)散系數(shù)的統(tǒng)計(jì)分布，取其中位數(shù)作為該樣本細(xì)胞表面ptk7分子的擴(kuò)散系數(shù)。
10、本專利技術(shù)還提供一種如上所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面ptk7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)在制備檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述產(chǎn)品可用于預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力和優(yōu)化腫瘤的治療方案，該產(chǎn)品檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的過程包括如下步驟：
11、s1、取用患者腫瘤部位組織一組以上的原發(fā)灶癌細(xì)胞、一組以上的轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞，使用如上所述的檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)得各組ptk7分子擴(kuò)散系數(shù)分布后，取其中位數(shù)作為該樣本細(xì)胞表面ptk7分子的擴(kuò)散系數(shù)(d值)，各d值的線性區(qū)間反映出不同侵襲轉(zhuǎn)移能力；
12、s2、取得患者腫瘤部位組織后分離培養(yǎng)出原代細(xì)胞，并使用如上所述的檢測(cè)系統(tǒng)得到擴(kuò)散系數(shù)分布及擴(kuò)散系數(shù)(d值)；
13、s3、將步驟s2測(cè)得的d值與步驟s1各細(xì)胞系的d值區(qū)間進(jìn)行比較，確定該患者癌細(xì)胞所具備的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
14、在一些實(shí)施例中，所述腫瘤部位為胰腺，對(duì)原代細(xì)胞測(cè)得的擴(kuò)散系數(shù)大于或等于0.17μm2本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面PTK7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，包括：
2.如權(quán)利要求1所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面PTK7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記單元為靶向PTK7的核酸適體。
3.如權(quán)利要求1所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面PTK7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記單元為靶向PTK7的多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面PTK7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記單元為靶向PTK7的肽核酸。
5.如權(quán)利要求1所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面PTK7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記單元為靶向PTK7的納米抗體。
6.如權(quán)利要求1所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面PTK7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，所述單分子示蹤熒光基團(tuán)為熒光染料，量子點(diǎn)及熒光蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面PTK7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，所述單分子示蹤熒光基團(tuán)選自ATTO、Alexa?Fluor、Cyanine系
8.一種如權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面PTK7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)在制備檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品可用于預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品可用于優(yōu)化腫瘤的治療方案。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面ptk7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，包括：
2.如權(quán)利要求1所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面ptk7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記單元為靶向ptk7的核酸適體。
3.如權(quán)利要求1所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面ptk7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記單元為靶向ptk7的多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面ptk7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記單元為靶向ptk7的肽核酸。
5.如權(quán)利要求1所述的基于單分子示蹤技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面ptk7分子擴(kuò)散系數(shù)的系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記單元為靶向ptk7的納米抗體。
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：譚蔚泓，孫洋，厲耀華，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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