【技術實現步驟摘要】
本申請涉及分子生物學領域，具體地，涉及同時檢測11種泌尿生殖系統病原體的試劑盒、方法及應用，更具體地，涉及一種引物組及其用途、試劑盒及其用途、泌尿生殖道病原體檢測方法。
技術介紹
1、非淋球菌性泌尿生殖道感染，最常見的是非淋菌性尿道炎(nongonococcalurethri?tis，ngu)。ngu是指除淋病奈瑟菌(neisseria?gonorrhoeae，ng)以外的其他病原體感染而引起的尿道炎。男性主要表現為尿道刺激癥狀，但不如淋病典型，主要表現為排尿不適，伴尿道分泌物增多，呈漿液性或漿液膿性。女性主要表現為白帶異常(量、色、味改變)，主要表現為非淋菌性尿道炎、陰道炎、宮頸炎、盆腔炎、子宮內膜炎等。
2、沙眼衣原體(chlamydia?trachomatis，ct)是ngu最常見的病原體，生殖支原體(myco?plasma?genitalium，mg)近年來也被證實是僅次于ct的ngu病原體，此外還有解脲脲原體(ureaplas?ma?urealyticum，uu)、微小脲原體(ureaplasma?par?vum，up)、人型支原體(mycoplasma?hominis，mh)、腺病毒(adenoviruses，adv)、陰道毛滴蟲(trichomonas?vaginalis，tv)、單純皰疹病毒(herpes?simplex?virus，hsv)、流感嗜血桿菌(hemophilusinfluenzae，hi)等。
3、流行病學研究表明，ct、mg、uu和mh是ngu最常見的病原體。其中，ct感
4、不同病原體導致的ngu治療差異顯著，因此精準檢測病原體對有效治療具有重要意義。臨床醫生更需要的是涵蓋ngu絕大部分病原體的組合檢測，以便確定感染病原體后精準用藥，尤其是ngu混合感染占比不斷提升的情況下，可以縮短患者治愈時間。目前市售ngu病原體檢測試劑盒多以單一或少數病原體為主，難以滿足混合感染的診斷需求。
5、不同病原體感染導致的ngu癥狀相似，但不同病原體感染的治療區別很大，ct、mg、uu感染一般首選四環素類藥物治療，次選為大環內酯類抗生素治療；mh由于基因組中攜帶有耐四環素的tetm基因，從而使四環素的應用受到局限，而且mh對14、15環類大環內酯類抗生素天然耐藥，現在臨床上用于治療mh感染的主要為喹諾酮類；ng治療首選頭孢曲松，次選大觀霉素；tv感染一般采用甲硝唑治療；hsv和adv感染一般按照病毒感染治療，hi感染首選喹諾酮類和大環內酯類抗生素治療。臨床醫生更需要的是涵蓋ngu絕大部分病原體的組合檢測，以便確定感染病原體后對癥下藥，尤其是ngu混合感染占比不斷提升的情況下，可以縮短患者治愈時間。
6、已經上市的ngu病原體dna檢測試劑盒均采用男性尿道分泌物或女性陰道分泌物作為檢測標本，上述標本采樣需要專業人員進行，同時可能會造成創傷。ngu屬于性傳播疾病，存在患者出于保護隱私而諱疾忌醫的情況，延誤了患者最佳治療時機，導致病原體的傳播。
技術實現思路
1、本申請旨在解決現有技術問題。為此，專利技術人針對2022年版《非淋球菌性尿道炎診療指南》提及的九種ngu感染病原體，包括解脲脲原體、沙眼衣原體、生殖支原體、微小脲原體、人型支原體、腺病毒、陰道毛滴蟲、單純皰疹病毒(包含hsv-i和hsv-ii)、流感嗜血桿菌的基因特異性保守序列設計引物探針，同時針對淋病奈瑟菌的基因特異性保守序列設計引物探針，提供一種實時熒光pcr檢測方法，低成本快速檢測11種病原體的基因，能夠對尿液和尿道(陰道)分泌物樣本中提取的核酸進行檢測。解決目前性傳播疾病病原體檢測方法培養法周期長、抗原法靈敏度差、多重感染情況下核酸單檢覆蓋低易漏檢的問題，是目前臨床急需的檢測產品。
2、由于ngu是一類癥狀相似的由支原體、衣原體、病毒、細菌、毛滴蟲等不同類型病原體感染引起的疾病的總稱，且多重感染率不斷上升，核酸單檢覆蓋低易漏檢。鑒于病原體尤其同類型病原體間基因同源性較高，且基因序列存在片段的重復性多、gc含量偏離以及特異性短片段少，而特異長片段的相互相干擾嚴重等特點，比如解脲脲原體、人型支原體以及生殖支原體引起的疾病癥狀類似，三種支原體存在一定的序列相似性，因此在合并感染的患者中得到的混合樣本進行pcr擴增時會產生相互干擾，繼而很容易產生錯誤的診斷結果，因此市面上產品較少。
3、此外，超多重pcr檢測試劑盒容易出現以下缺陷：1)不同病原體間由于基因同源性、基因序列存在較多的重復性片段，pcr擴增時容易出現非特異性擴增的干擾；2)不同病原體存在特異性導致擴增效率不同，最終不同病原體檢測的靈敏度高低不同；3)由于pcr儀器不同檢測通道的偏好性，會出現熒光值和靈敏度的差異。
4、針對缺陷1)，本申請提供了一組互不干擾且同步檢測11種非淋球菌性尿道炎感染病原體的引物探針的組合物，從ncbi、ensembl等公共數據庫下載所需要的序列文件，通過blast等工具進行序列比對分析病原體靶標基因的同源性，發現解脲脲原體和微小脲原體的ure編碼基因的序列同源性為93.7％；單純皰疹病毒i型和ii型us編碼基因的序列同源性為50.0％；腺病毒型別復雜，已報道引起尿道炎的腺病毒型別主要有hadv-4(e亞群)，hadv-35(b亞群)，hadv-9，37，49，56(d亞群)。55型腺病毒是由人11型和14型腺病毒重組產生的新型病毒，屬于b組b2亞組。經過同源性序列比對，在引物設計時避開同源性高的區域。本申請選擇不同病原體不同的編碼基因設計引物，成功地避免了病原體間的干擾交叉，沙眼衣原體(ct)選擇pgp編碼基因、解脲脲原體(uu)選擇ureb編碼基因、微小脲原體(up)選擇urea編碼基因、人型支原體(mh)選擇gap編碼基因、生殖支原體(mg)選擇mgp編碼基因、淋病奈瑟菌(ng)選擇pora編碼基因、單純皰疹病毒i型(hsv-i)選擇us5編碼基因、單純皰疹病毒ii型(hsv-ii)選擇us3編碼基因、腺病毒(adv)選擇p1編碼基因、流感嗜血桿菌(hi)選擇proteind編碼基因、陰道毛滴蟲(tv)選擇ribosomalrna編碼基因。
5、針對缺陷2)，本申請針對每種病原體設計多對引物，經過反復篩選每種病原體多對引物，本申請最終提供的用于檢測11種ngu病原體的引物、探針組合，檢測效率高且一致，檢測結果準確，可以低成本快速完成病原體診斷。
6、針對缺陷3)，本申請在篩選出各病原體特異性最好、擴增效率最接近的引物對后，進一步利用pcr儀器的偏好性，平本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種引物組，其特征在于，用于檢測泌尿生殖道病原體；
2.根據權利要求1所述的引物組，其特征在于，所述引物組序列如SEQ?ID?NO:1-2、4-5、7-8、10-11、13-14、16-17、19-20、22-23、25-26、28-29、31-32所示；
3.一種試劑盒，其特征在于，包括：權利要求1或2所述的引物組。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，進一步包括：用于檢測泌尿生殖道病原體的熒光探針；
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，進一步包括：反應試劑、陽性對照和陰性對照；
6.權利要求1-2任一項所述的引物組或權利要求3-5任一項所述的試劑盒在檢測泌尿生殖道病原體中的用途。
7.一種泌尿生殖道病原體檢測方法，其特征在于，包括：
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述待測樣本選自尿液中的DNA。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述擴增是在擴增反應體系中進行的，在所述擴增反應體系中，引物的終濃度為100nM-1000nM；
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...【技術特征摘要】
1.一種引物組，其特征在于，用于檢測泌尿生殖道病原體；
2.根據權利要求1所述的引物組，其特征在于，所述引物組序列如seq?id?no:1-2、4-5、7-8、10-11、13-14、16-17、19-20、22-23、25-26、28-29、31-32所示；
3.一種試劑盒，其特征在于，包括：權利要求1或2所述的引物組。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，進一步包括：用于檢測泌尿生殖道病原體的熒光探針；
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，進一步包括：反應試劑、陽性...
【專利技術屬性】
技術研發人員：安運平，李雯萍，賈靜靜，張龍輝，王放放，
申請(專利權)人：萃真生物鄭州有限公司，
類型：發明
國別省市：
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