【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物細胞領(lǐng)域技術(shù)，尤其是指一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、基因編輯（gene?editing）是指通過基因編輯技術(shù)對生物體基因組特定目標(biāo)進行修飾的過程。高效而精準的實現(xiàn)基因插入、缺失或替換，從而改變其遺傳信息和表現(xiàn)型特征。
2、迄今為止，基于體外和體內(nèi)研究的imsc評估顯示，與原代或天然人來源msc相比，在細胞增殖、擴增能力、免疫調(diào)節(jié)特性以及旁分泌信號傳導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)的影響方面，imsc具有更優(yōu)越的性能。
3、vegfa是一種糖蛋白，由兩個結(jié)構(gòu)域組成：細胞外區(qū)域和細胞內(nèi)區(qū)域。細胞外區(qū)域具有多種生物學(xué)活性，如刺激血管內(nèi)皮生長、促進血管新生等。細胞內(nèi)區(qū)域含有血管內(nèi)皮生長因子a基因（vegfa基因），該基因編碼的蛋白質(zhì)在血管內(nèi)皮細胞中發(fā)揮重要作用。
4、現(xiàn)有技術(shù)未通過基因編輯的方式構(gòu)建一種穩(wěn)定、長期過表達vegfa的imsc細胞株，不便應(yīng)用于下肢缺血的癥狀；因此，針對此現(xiàn)狀，迫切需要開發(fā)一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法及應(yīng)用，以滿足實際需要。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)針對現(xiàn)有技術(shù)存在之缺失，其主要目的是提供一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法及應(yīng)用，該構(gòu)建方法為使用基因編輯的crispr系統(tǒng)，把vegfa基因?qū)雐psc基因組中，
2、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下之技術(shù)方案：
3、一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
4、s1、針對插入位點aavs1設(shè)計sgrna以及ssdna，檢測sgrna的切割效率；
5、s2、通過電穿孔的方式，向細胞中導(dǎo)入crispr系統(tǒng)，獲得定點插入外源基因vegfa的ipsc細胞株；
6、s3、將ipsc細胞株向imsc進行定向誘導(dǎo)分化，獲得過表達vegfa蛋白的imsc細胞株。
7、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s1中檢測sgrna的切割效率具體為：將cas9蛋白和sgrna孵育的rnp轉(zhuǎn)染至293t細胞中，收集細胞，提取基因組dna，以該dna為模板進行pcr擴增，引物如seq?id?no:3與seq?id?no:4所示；pcr產(chǎn)物經(jīng)sanger測序后驗證切割效率。
8、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s1中sgrna為化學(xué)合成的rna，sgrna序列是能夠引導(dǎo)cas9蛋白精確切割aavs1位點的序列，sgrna序列如seq?id?no:1所示。
9、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s2中crispr系統(tǒng)包括sgrna、cas9蛋白以及編碼vegfa的單鏈dna供體模版。
10、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s2中向細胞中導(dǎo)入crispr系統(tǒng)具體為：cas9蛋白和sgrna混和，在室溫下孵育形成rnp混合物，通過電穿孔的形式把rnp混合物和ssdna共同導(dǎo)入宿主細胞中。
11、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s2中該宿主細胞為ipsc細胞，該rnp混合物中sgrna和cas9蛋白的摩爾比為1:1-1:3。
12、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s2中定點插入外源基因vegfa的ipsc細胞株的vegfa蛋白表達序列包括啟動子、同源臂、vegfa蛋白cds區(qū)序列、連接肽、嘌呤霉素cds區(qū)序列和終止子，該啟動子為ef1α啟動子序列，該連接肽為p2a，該終止子為bgh?poly(a)信號序列，vegfa蛋白表達序列如seq?id?no:2所示。
13、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s2中通過電穿孔的方式向細胞中導(dǎo)入crispr系統(tǒng)后進行細胞的篩選、培養(yǎng)及鑒定，選擇具有插入序列的ipsc細胞株。
14、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s3中誘導(dǎo)分化為體外誘導(dǎo)分化；將ipsc細胞株向imsc進行定向誘導(dǎo)分化具體為：ipsc細胞株經(jīng)過第一階段誘導(dǎo)培養(yǎng)形成神經(jīng)嵴細胞系，神經(jīng)嵴細胞系經(jīng)過第二階段誘導(dǎo)向imsc方向分化，得到能夠過表達vegfa蛋白的imsc細胞株。
15、所述的一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法的應(yīng)用，所述構(gòu)建方法獲得過表達vegfa蛋白的imsc細胞株應(yīng)用于制備缺血相關(guān)疾病的細胞藥物。
16、本專利技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點和有益效果，具體而言，由上述技術(shù)方案可知，本專利技術(shù)提供一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍生間充質(zhì)干細胞（imsc）細胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，該構(gòu)建方法為使用基因編輯的crispr系統(tǒng)，把vegfa基因?qū)雐psc基因組中，實現(xiàn)vegfa蛋白的高表達，然后將ipsc細胞株向imsc進行定向誘導(dǎo)分化，就得到過表達vegfa蛋白的imsc；本專利技術(shù)的過表達vegfa蛋白的imsc能夠很好的刺激血管內(nèi)皮生長、促進血管新生，為缺血相關(guān)疾病的修復(fù)治療提供更多可能。
17、為更清楚地闡述本專利技術(shù)的結(jié)構(gòu)特征和功效，下面結(jié)合附圖與具體實施例來對其進行詳細說明。
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1.一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)過表達VEGFA基因的iPSC衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)過表達VEGFA基因的iPSC衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟S1中檢測sgRNA的切割效率具體為：將Cas9蛋白和sgRNA孵育的RNP轉(zhuǎn)染至293T細胞中，收集細胞，提取基因組DNA，以該DNA為模板進行PCR擴增，引物如SEQ?ID?NO:3與SEQ?ID?NO:4所示；PCR產(chǎn)物經(jīng)sanger測序后驗證切割效率。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)過表達VEGFA基因的iPSC衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟S1中sgRNA為化學(xué)合成的RNA，sgRNA序列是能夠引導(dǎo)Cas9蛋白精確切割A(yù)AVS1位點的序列，sgRNA序列如SEQ?ID?NO:1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)過表達VEGFA基因的iPSC衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟S2中C
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)過表達VEGFA基因的iPSC衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟S2中向細胞中導(dǎo)入CRISPR系統(tǒng)具體為：Cas9蛋白和sgRNA混和，在室溫下孵育形成RNP混合物，通過電穿孔的形式把RNP混合物和ssDNA共同導(dǎo)入宿主細胞中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)過表達VEGFA基因的iPSC衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟S2中該宿主細胞為iPSC細胞，該RNP混合物中sgRNA和Cas9蛋白的摩爾比為1:1-1:3。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)過表達VEGFA基因的iPSC衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟S2中定點插入外源基因VEGFA的iPSC細胞株的VEGFA蛋白表達序列包括啟動子、同源臂、VEGFA蛋白CDS區(qū)序列、連接肽、嘌呤霉素CDS區(qū)序列和終止子，該啟動子為EF1α啟動子序列，該連接肽為P2A，該終止子為bGH?Poly(A)信號序列，VEGFA蛋白表達序列如SEQ?ID?NO:2所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)過表達VEGFA基因的iPSC衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟S2中通過電穿孔的方式向細胞中導(dǎo)入CRISPR系統(tǒng)后進行細胞的篩選、培養(yǎng)及鑒定，選擇具有插入序列的iPSC細胞株。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)過表達VEGFA基因的iPSC衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟S3中誘導(dǎo)分化為體外誘導(dǎo)分化；將iPSC細胞株向iMSC進行定向誘導(dǎo)分化具體為：iPSC細胞株經(jīng)過第一階段誘導(dǎo)培養(yǎng)形成神經(jīng)嵴細胞系，神經(jīng)嵴細胞系經(jīng)過第二階段誘導(dǎo)向iMSC方向分化，得到能夠過表達VEGFA蛋白的iMSC細胞株。
10.一種如權(quán)利要求1-9任意一項所述的一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)過表達VEGFA基因的iPSC衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法的應(yīng)用，其特征在于：所述構(gòu)建方法獲得過表達VEGFA蛋白的iMSC細胞株應(yīng)用于制備缺血相關(guān)疾病的細胞藥物。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟s1中檢測sgrna的切割效率具體為：將cas9蛋白和sgrna孵育的rnp轉(zhuǎn)染至293t細胞中，收集細胞，提取基因組dna，以該dna為模板進行pcr擴增，引物如seq?id?no:3與seq?id?no:4所示；pcr產(chǎn)物經(jīng)sanger測序后驗證切割效率。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟s1中sgrna為化學(xué)合成的rna，sgrna序列是能夠引導(dǎo)cas9蛋白精確切割aavs1位點的序列，sgrna序列如seq?id?no:1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟s2中crispr系統(tǒng)包括sgrna、cas9蛋白以及編碼vegfa的單鏈dna供體模版。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍生間充質(zhì)干細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟s2中向細胞中導(dǎo)入crispr系統(tǒng)具體為：cas9蛋白和sgrna混和，在室溫下孵育形成rnp混合物，通過電穿孔的形式把rnp混合物和ssdna共同導(dǎo)入宿主細胞中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于crispr/cas9技術(shù)過表達vegfa基因的ipsc衍...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：胡雋源，蔡車國，廖延，蔣美玲，伍世鐸，胡志偉，李端端，
申請(專利權(quán))人：深圳市北科生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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