【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種用于pedv體外培養(yǎng)的腸道類器官，特別涉及一種用于pedv體外培養(yǎng)的豬腸類器官與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系，還涉及該共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法和在pedv體外培養(yǎng)中的應(yīng)用，本專利技術(shù)屬于病毒培養(yǎng)。
技術(shù)介紹
1、豬流行性腹瀉病毒（porcine?epidemic?diarrhea?virus，pedv）是豬腸道主要致病性病毒，具有高度傳染性，是仔豬發(fā)病和死亡的主要原因，造成養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。然而，這種病毒在體外感染和增殖主要以非腸道來源的vero細(xì)胞為主。然而，vero細(xì)胞來源于非洲綠色猴腎，它在pedv感染后可能產(chǎn)生的相關(guān)生物信息可能與豬腸道體內(nèi)并不一致，應(yīng)慎重考慮其在先天免疫應(yīng)答中的作用研究，它并不能代表pedv在體內(nèi)的真正作用機制。直接從樣品分離出的pedv野毒需要在vero細(xì)胞上多次盲傳后才能獲得細(xì)胞馴化株，且細(xì)胞馴化株往往發(fā)生突變而改變原有毒株的特征。更重要的是，在目前的體外培養(yǎng)細(xì)胞系上，需要通過胰酶預(yù)處理來切割pedv，暴露其抗原結(jié)合位點后才能引起進(jìn)一步的感染，這顯然與pedv的自然感染不完全一致，因此限制了對pedv的致病機理和調(diào)節(jié)宿主天然免疫應(yīng)答的研究。
2、研究人員建立了幾個豬小腸上皮細(xì)胞系，如豬小腸上皮細(xì)胞ipec-j2和回腸上皮細(xì)胞ipi-21，它們分別來自豬空腸和回腸。然而，ipec-j2和ip-21細(xì)胞中的病毒感染率非常低，并且這些細(xì)胞模型無法完全代替豐富的腸道上皮細(xì)胞類型和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。且流行毒株的體外分離和培養(yǎng)是研究pedv的基礎(chǔ)，這通常需要額外添加胰酶來實現(xiàn)。pedv毒株普遍對胰酶
3、腸道類器官是由多種腸細(xì)胞類型組成的體外培養(yǎng)模型，含有完全成熟的杯狀細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞等，具有中空腔的花瓣狀結(jié)構(gòu)，含有絨毛和隱窩樣結(jié)構(gòu)域，能夠長期自我更新，并且它們可以穩(wěn)定地冷凍保存和復(fù)蘇，為在體外系統(tǒng)中研究宿主與病原體相互作用提供了獨特的平臺。最近的一項研究表明，豬腸道類器官（pios）比豬小腸上皮細(xì)胞（ipec）更接近上皮組織，并且在生理上比現(xiàn)有細(xì)胞系更接近體內(nèi)條件。然而，由于當(dāng)前3d培養(yǎng)條件下腸道類器官中腸上皮細(xì)胞微絨毛完全內(nèi)置于球體內(nèi)部，這使得大多數(shù)利用腸絨毛頂端膜入侵機體的病原微生物難以感染該類器官，從而使得相關(guān)病原-宿主相互作用的研究難以開展。
4、為了解決上述問題，研究人員建立了幾種解決方案，例如，通過用胰蛋白酶處理形成2d單層腸類器官，然后加入病原微生物；將病原微生物直接注射到腸類器官腔等。然而體外培養(yǎng)的腸道類器官雖然擁有了胃腸道復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)表型，但是與真實胃腸道相比缺少免疫細(xì)胞的參加。
5、為實現(xiàn)原代pedv的體外培養(yǎng)，本專利技術(shù)首次建立了豬回腸類器官與豬腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系,?為探討pedv感染腸道細(xì)胞的生物學(xué)特性及致病機制提供了可靠平臺，對了解斷奶仔豬pedv的發(fā)病機制以及開發(fā)預(yù)防pedv感染的藥物或方法具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種可用于pedv體外培養(yǎng)的豬腸類器官與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
2、為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用了以下技術(shù)手段：
3、本專利技術(shù)的一種豬腸類器官與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，包括將豬回腸類器官與豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的步驟，其中，所述的豬回腸類器官與豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)是按照以下步驟進(jìn)行：
4、（1）對豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇：從液氮中取出豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞凍存管，放入37℃水浴中直至細(xì)胞懸液完全融化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入?rpmi1640，混勻后離心，棄去上清；
5、（2）豬回腸類器官是由仔豬回腸腸段分離的隱窩干細(xì)胞通過類器官分化培養(yǎng)后得到，將豬回腸類器官培養(yǎng)1-2天后，棄去原有培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的pbs吹打腸類器官到離心管中，用預(yù)冷的pbs沖洗孔底，加入到同一個離心管中，離心，棄去上清液；
6、（3）將100個豬回腸類器官與105個小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞混勻，加入dmem/f12培養(yǎng)液，在37℃含有5%?co2的培養(yǎng)箱中孵育30?min；
7、（4）孵育完成后，將細(xì)胞懸液以?1500rpm/min?離心?5?min，將細(xì)胞顆粒重懸于基質(zhì)膠中，并移至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將?48?孔板放在37℃和?5%?co2的培養(yǎng)箱中孵育?15min后，向每個含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中加入?200?μl?含有1%?v/v青霉素-鏈霉素混合液及100u/ml?il-2的intesticult?人腸類器官生長培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃含有5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即得到所述的豬腸類器官與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系。
8、其中，優(yōu)選的，所述的豬回腸類器官通過以下步驟制備得到：
9、（1）將基質(zhì)膠在冰上解凍，同時預(yù)冷pbs并加入2%v/v的青霉素-鏈霉素混合液于預(yù)冷后的pbs中，用于以下實驗；
10、（2）截取7日齡豬5~10?cm的回腸段，置于含有上述預(yù)冷的pbs的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；
11、（3）沖洗回腸段中的內(nèi)容物，直至腸內(nèi)容物完全去除，然后棄去沖洗液；
12、（4）在另一個新的培養(yǎng)皿中加入上述預(yù)冷的pbs，將洗滌后的腸段放入培養(yǎng)皿中，將其剪成1-3mm的小段，將含有腸段的組織懸液轉(zhuǎn)移到50?ml離心管中，使腸道碎片自然沉降；
13、（5）去除離心管中的上層液體，再加入上述預(yù)冷的pbs；重復(fù)此洗滌步驟，直至上清液變得清澈；
14、（6）去除上清液后，將腸段重懸于10?ml?溫和細(xì)胞解離液中，在室溫下，以100?rpm的速度在搖床上孵育20?min；
15、（7）孵育完成后，讓腸段自然沉降，并棄去上清液，然后加入10?ml含有1%?v/v胎牛血清（fbs）的上述預(yù)冷的pbs，上下移動腸道碎片；
16、（8）待大部分腸段碎片沉降后，收集上清液，通過70?μm濾器過濾，并將濾液注入15ml離心管內(nèi)，此步驟重復(fù)進(jìn)行4~5次；
17、（9）在4℃下將濾液以1200?rpm離心5?min，棄去上清液，收集隱窩碎片沉淀；用dmem/f12培養(yǎng)基將隱窩碎片沉淀懸起后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；
18、（10）在4℃下，以1200?rpm的速度將懸液離心5分鐘，棄去上清液，按照每50個隱窩干細(xì)胞加入25?μl?intesticult?人腸類器官生長培養(yǎng)液和25μl基質(zhì)膠的比例，向隱窩干細(xì)胞中加入intesticult?人腸類器官生長培養(yǎng)液和基質(zhì)膠，將50μl的隱窩干細(xì)胞懸浮液移至細(xì)胞培養(yǎng)板；
19、（11）將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育15?min，使基質(zhì)膠固化，然后向每個含有隱窩干細(xì)胞的培養(yǎng)孔本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.豬腸類器官與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的方法包括將豬回腸類器官與豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的步驟，其中，所述的豬回腸類器官與豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)是按照以下步驟進(jìn)行：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的豬回腸類器官通過以下步驟制備得到：
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是通過以下步驟制備得到：
4.按照權(quán)利要求1-3任一項所述的方法構(gòu)建得到的豬腸類器官與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系。
5.權(quán)利要求4所述的豬腸類器官與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系在培養(yǎng)豬流行性腹瀉病毒中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉病毒細(xì)胞馴化株或豬流行性腹瀉病毒野毒株。
【技術(shù)特征摘要】
1.豬腸類器官與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的方法包括將豬回腸類器官與豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的步驟，其中，所述的豬回腸類器官與豬小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)是按照以下步驟進(jìn)行：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的豬回腸類器官通過以下步驟制備得到：
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的豬小腸上...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：單智夫，李佳璇，王曉娜，王瑩，魏志穎，唐麗杰，喬薪瑗，王麗，姜艷平，崔文，
申請(專利權(quán))人：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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