【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及核酸純化領(lǐng)域，具體涉及基于sdvb反相柱純化環(huán)狀rna的方法。
技術(shù)介紹
1、反相高效液相色譜是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，它正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系。
2、rp-hplc的典型的固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型的流動相是甲醇和乙腈。rp-hplc是當(dāng)今液相色譜的最主要的分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機(jī)物的分離。反相色譜法適于分離非極性、極性或離子型化合物，大部分的分析任務(wù)皆由反相色譜法完成。
3、mrna疫苗是將含有編碼抗原蛋白的mrna導(dǎo)入人體，直接進(jìn)行翻譯，形成相應(yīng)的抗原蛋白，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，達(dá)到預(yù)防免疫的作用。而環(huán)狀rna(circrnas，circularrnas)是一類單鏈、閉環(huán)的新型rna。與傳統(tǒng)的線性rna(linearrna，含5’和3’末端)不同，circrna分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受rna外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解。
4、環(huán)狀rna純化方面存在一些已公開的方法，cn101563457a(公開日期2009年10月21日)公開了用于制備型純化rna的方法，該方法的特征在于使用多孔反相作為固定相利用hplc來純化rna，該專利技術(shù)的一個(gè)重要因素是使用多孔反相。cn112399860a公布了一種純化環(huán)狀rna的方法，該方法包括使rna通過高效液相色譜(hplc)系統(tǒng)中的tris-edta或檸檬酸鹽緩沖液中的尺寸排阻柱，去除以下一種或多種：內(nèi)含子片段、帶切口的線性rna、線性和環(huán)
5、整體柱又稱為第四代層析技術(shù)，其具有整體柱的高載量、高流速以及高分辨率等特點(diǎn)。賽多利斯整體柱已廣泛應(yīng)用于cgt領(lǐng)域，賽多利斯cim?multus?tm?sdvb使用基于苯乙烯-二乙烯基苯(sdvb)的反相色譜法來從截短rna、ssrna和環(huán)狀rna混合物中分離環(huán)狀rna。
6、雖然hplc是本領(lǐng)域分離rna的常規(guī)方法，但不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，為了提高產(chǎn)率，大規(guī)模分析純化，本領(lǐng)域亟需提供一種能夠大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的純化方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的之一是提供一種分離效果好、能夠大量應(yīng)用的環(huán)狀rna純化方法。本專利技術(shù)對不同有機(jī)相梯度改變探索，獲得適合環(huán)狀rna分離的方法，從而能有效分離ivt產(chǎn)物中的環(huán)狀rna。
2、本專利技術(shù)的一方面，提供一種基于sdvb反相柱純化環(huán)狀rna的方法。其特征在于，包含如下步驟：
3、(1)樣品制備：ivt反應(yīng)制備mrna，并進(jìn)行環(huán)化和純化，獲得環(huán)化且純化后的環(huán)狀rna，rnaser消化后的環(huán)狀rna以及rnaser消化后且純化后的環(huán)狀rna；
4、(2)流動相配制：
5、配方一：流動相a:10-200mm冰醋酸+三乙胺的中性混合溶液
6、(teaa)；流動相b:10-200mm冰醋酸+三乙胺的中性混合溶液(teaa)
7、+10-25％乙腈
8、配方二：流動相a:5-25mm?n-二異丙基乙胺(dipea)+10-100mm六氟異丙醇(hfip)；流動相b:5-25mm?mm?n-二異丙基乙胺(dipea)+10-100mm六氟異丙醇(hfip)+10-25％乙腈
9、配方三：流動相a:5-25mm?tae+300-500mm六氟異丙醇(hfip)流動相b:5-25mm?tae+300-500mm六氟異丙醇(hfip)+10-25％乙腈配方四：流動相a:50-250mm醋酸己胺溶液(haa)；流動相b:50-250mm?mm醋酸己胺溶液(haa)+10-25％乙腈
10、(3)色譜分離：設(shè)置梯度為40-60％，25.0-100.0cv，期間根據(jù)uv260響應(yīng)值收集主峰，不同的峰分開收集；
11、(4)分別收集環(huán)狀rna和雜質(zhì)的目標(biāo)色譜峰。
12、(5)目標(biāo)峰的超濾：超濾方法為超濾管和膜包換液，兩倍體積換液，置換8-11次。。
13、進(jìn)一步地，步驟(1)ivt轉(zhuǎn)錄時(shí)間為1-8h，環(huán)化溫度37-55℃，環(huán)化時(shí)間為5-60min。
14、進(jìn)一步地，步驟(1)純化方式有且不限于licl沉淀和疏水層析。
15、進(jìn)一步地，步驟(1)中體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為任意的mrna體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
16、進(jìn)一步的，還包括步驟(3)上樣量為0.2-2.0mg/ml。
17、進(jìn)一步地，還包含步驟(3)獲得色譜圖譜。
18、進(jìn)一步地，步驟(5)包含：將經(jīng)過超濾的環(huán)狀rna進(jìn)行凝膠電泳表征和生物分析儀分析。
19、進(jìn)一步地，步驟(5)包含：將純化得到的環(huán)狀rna進(jìn)行體外長效表達(dá)。
20、本專利技術(shù)公開了一種基于sdvb反相純化環(huán)狀rna的方法，包括如下步驟：
21、1)樣品制備：通過轉(zhuǎn)錄獲得rna產(chǎn)物并進(jìn)行環(huán)化處理；
22、2)制備流動相：所述流動相a為冰醋酸-三乙胺溶液，流動相b為冰醋酸-三乙胺溶液和乙腈的混合溶液；或，所述流動相a為冰醋酸-三乙胺溶液或者n-二異丙基乙胺(dipea)-六氟異丙醇(hfip)溶液，流動相b為冰醋酸-三乙胺溶液和乙腈的混合溶液或者nn-二異丙基乙胺(dipea)-六氟異丙醇(hfip)溶液和乙腈的混合溶液；或流動相a為tae-六氟異丙醇(hfip)溶液，流動相b為tae-六氟異丙醇(hfip)溶液和乙腈的混合液；或流動相a為醋酸己胺溶液(haa)，流動相b為醋酸己胺溶液(haa)和乙腈混合液。；
23、3)上樣：將所述樣品注射到進(jìn)樣環(huán)中，采用的色譜柱為苯乙烯-二乙烯基苯(sdvb)層析柱；
24、4)洗脫：設(shè)置梯度，于25.0～100.0cv條件下洗脫；
25、5)樣品收集超濾：根據(jù)uv260響應(yīng)值收集主峰洗脫液，并進(jìn)行超濾濃縮。
26、優(yōu)選的，步驟2)中的流動相a為10-100mm冰醋酸-三乙胺溶液，所述流動相b為10-100mm冰醋酸-三乙胺溶液+10-25％乙腈。
27、優(yōu)選的，步驟3)中的上樣量為0.5-2mg/ml。
28、優(yōu)選的，步驟2)中的流動相a的ph值為7.0±0.5，流動相b的ph值為7.5。
29、優(yōu)選的，所述流動相a的制備方法如下：5.6ml冰醋酸，13.86ml三乙胺，加入rnasefree水定容到1000ml，調(diào)節(jié)ph至7.0±0.5。可以擴(kuò)大體積配置。
30、優(yōu)選的，所述流動相b的制備方法如下：5.6ml冰醋酸，13.86ml三乙胺，250ml乙腈，加入rn本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于SDVB反相純化環(huán)狀RNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟2)中的流動相A為10-100mM冰醋酸-三乙胺溶液或者N-二異丙基乙胺-六氟異丙醇溶液或TAE-六氟異丙醇(HFIP)溶液或醋酸己胺溶液(HAA)，所述流動相B為10-100mM冰醋酸-三乙胺溶液或N-二異丙基乙胺-六氟異丙醇溶液或TAE-六氟異丙醇(HFIP)溶液或醋酸己胺溶液(HAA)和乙腈混合溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3)中的上樣量為0.5-2mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟2)中的流動相A的pH值為7.0±0.5，流動相B的pH值為7.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟4)中的洗脫梯度為0-40％12.5CV；40-60％75.0CV；60-100％12.5CV。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：進(jìn)一步包括對制備濃縮的環(huán)狀RNA樣品進(jìn)行檢測的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述的檢
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述環(huán)狀RNA為人促紅細(xì)胞生成素環(huán)狀RNA(oRNA-hepo)或熒光素酶環(huán)狀RNA(oRNA-luci)。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于sdvb反相純化環(huán)狀rna的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟2)中的流動相a為10-100mm冰醋酸-三乙胺溶液或者n-二異丙基乙胺-六氟異丙醇溶液或tae-六氟異丙醇(hfip)溶液或醋酸己胺溶液(haa)，所述流動相b為10-100mm冰醋酸-三乙胺溶液或n-二異丙基乙胺-六氟異丙醇溶液或tae-六氟異丙醇(hfip)溶液或醋酸己胺溶液(haa)和乙腈混合溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3)中的上樣量為0.5-2mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟2)中的流動...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李琴，鄭志濤，胡榮寬，向晟楠，劉強(qiáng)，孫濤，
申請(專利權(quán))人：星銳醫(yī)藥蘇州有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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