【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及il-1β革蘭氏陰性菌感染檢測，更具體地說是il-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法。
技術介紹
1、瓦氏黃顙魚(pelteobagrusvachellii)隸屬于鲇形目、鲿科、黃顙魚屬，是黃顙魚屬中最大的一個種，最大長達300mm。其肉嫩味美，營養豐富、生長迅速，深受消費者和養殖者的喜愛，現已成為一種重要的淡水名優經濟養殖魚種。隨著瓦氏黃顙魚高密度的人工養殖，養殖魚體的免疫力和養殖環境雙重下降，導致病害頻發，給瓦氏黃顙魚養殖業造成了嚴重的損失。
2、1972年，grey等發現了白細胞介素1(interleukin-1，il-1)是一種能激活多種免疫細胞和炎癥細胞的前炎性細胞因子。il-1主要由單核-巨噬細胞和嗜中性粒細胞等產生。根據其分子的結構和等電點不同，可分為il-1α和il-1β。其中il-1β具有廣泛的生物活性，是體內作用最強的炎癥介質之一。魚類的il-1α暫未發現，但il-1β已在虹鱒(oncorhynchusmykiss)發現，且相繼在鮭科、鯉科和鱸科等硬骨魚中克隆得到。il-1β在正常血液中的濃度的含量很低，但在理化和生理等因素的誘導下，il-1β能夠促進血管內皮-白細胞黏附分子的表達，趨化嗜中性粒細胞等炎性細胞進入機體病變部位，il-1βmrna的表達，且其表達量的高低與炎癥程度呈正相關，因此常作為臨床上判斷疾病嚴重程度和療效的指標。關于il-1β在魚類感染和免疫中的作用研究發現：黃顙魚的il-1βmrna在鮰愛德華氏菌(edwardsiellaictaluri)感染后在多臟器出
3、在疾病防治過程中，不規范使用抗生素常造成漁藥殘留和細菌耐藥，嚴重影響了水體環境和魚肉品質。為了研究il-1β在瓦氏黃顙魚在免疫和疾病防治中的作用，本專利技術提出一種il-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，為il-1β在細菌性疾病的早期防治奠定基礎。
技術實現思路
1、為了克服現有技術的上述缺陷，本專利技術提供il-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，有助于了解魚體的免疫狀態，為魚類細菌性疾病的早期防治奠定基礎。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：il-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，具體步驟如下：
3、步驟1、采集魚類樣本；
4、步驟2、提取總rna；
5、步驟3、合成cdna；
6、步驟4、il-1β的克?。?/p>
7、以脾臟cdna為模板，以pf-il-1βf和pf-il-1βr為引物，進行pcr擴增；
8、步驟5、檢測il-1β的組織分布：
9、以魚類各組織臟器cdna為模板，分別使用q-瓦-il-1βf/r和內參引物β-actinf/r進行sybrgreen染料法熒光定量pcr檢測，每個cdna做3個平行實驗，計算2-△△ct。
10、步驟6、統計與分析。
11、優選地，步驟1中，魚類樣本包括心、肝、脾、腎、肌肉、頭腎、前腸、中腸、后腸、胃、鰓和腦12個樣本，樣本分別置于rnastore中4℃過夜保存，24h后轉入-80℃低溫保存。
12、優選地，步驟2中，總rna的提取的具體步驟如下：
13、s1、樣本解凍后，取組織樣品50-100mg，加入1ml?trizol后，室溫靜置5min，使其充分裂解；
14、s2、在樣本ep管中加入4顆小鋼珠，置于組織勻漿機上勻漿40s，15-30℃放置5min(使核蛋白復合體徹底分離)，12000r/min4℃，離心5min，取上清，棄沉淀；
15、s3、向上清中加入200μl氯仿，劇烈振蕩混勻，室溫放置15min；
16、s4、4℃，12000r/min離心15min，離心后分成三層，吸取上層水相，轉移至另一離心管中；
17、s5、加入等體積異丙醇，溫和振蕩離心管，室溫放置5-10min，4℃，12000r/min，離心10min，棄上清；
18、s6、加入1ml?75％乙醇，溫和振蕩離心管，4℃，12000r/min，離心5min，棄上清，室溫晾干5-10min；
19、s7、向管中加入50μl?rnase-free?ddh2o溶解沉淀物；
20、s8、使用1％的瓊脂凝膠電泳檢測rna的質量，使用核酸檢測儀測定總rna濃度，提取的rna保存于-80℃備用。
21、優選地，步驟3的具體步驟為：將步驟2中提取的總rna使用rnase-free?ddh2o稀釋至終濃度為100ng/μl，參照cdna反轉錄試劑盒試劑盒進行cdna反轉錄。
22、優選地，步驟4中，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、t克隆獲，氨芐青霉素鈉篩選后的陽性菌株測序，測序序列上傳ncbi進行blast比對，下載不同相似性的多個同源序列，使用dnaman進行進化樹構建。
23、優選地，步驟6中，使用prism5.0進行顯著性分析。
24、本專利技術的技術效果和優點：
25、本專利技術方法通過克隆瓦氏黃顙魚il-1β基因，分析其組織分布，以及脂多糖刺激后的mrna水平。本專利技術的方法有助于了解魚體的免疫狀態，為il-1β在魚類細菌性疾病的早期防治奠定基礎。
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1.IL-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，其特征在于，具體步驟如下：
2.根據權利要求1所述的IL-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，其特征在于，步驟1中，魚類樣本包括心、肝、脾、腎、肌肉、頭腎、前腸、中腸、后腸、胃、鰓和腦12個樣本，樣本分別置于RNAstore中4℃過夜保存，24h后轉入-80℃低溫保存。
3.根據權利要求2所述的IL-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，其特征在于，步驟2中，總RNA的提取的具體步驟如下：
4.根據權利要求1所述的IL-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，其特征在于，步驟3的具體步驟為：將步驟2中提取的總RNA使用RNase-Free?ddH2O稀釋至終濃度為100ng/μL，參照cDNA反轉錄試劑盒試劑盒進行cDNA反轉錄。
5.根據權利要求1所述的IL-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，其特征在于，步驟4中，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、T克隆獲，氨芐青霉素鈉篩選后的陽性菌株測序，測序序列上傳NCBI進行Blast比對，下載不同相似性的多個同源序列，
6.根據權利要求1所述的IL-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，其特征在于，步驟6中，使用Prism5.0進行顯著性分析。
...【技術特征摘要】
1.il-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，其特征在于，具體步驟如下：
2.根據權利要求1所述的il-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，其特征在于，步驟1中，魚類樣本包括心、肝、脾、腎、肌肉、頭腎、前腸、中腸、后腸、胃、鰓和腦12個樣本，樣本分別置于rnastore中4℃過夜保存，24h后轉入-80℃低溫保存。
3.根據權利要求2所述的il-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，其特征在于，步驟2中，總rna的提取的具體步驟如下：
4.根據權利要求1所述的il-1β革蘭氏陰性菌感染早期預警因子檢測方法，其特征在于，步驟3的具...
【專利技術屬性】
技術研發人員：賀揚，王均，王苗苗，付燕，蔣蕊澤，李華濤，李武，但宇，王亞東，王琦，皮小蘭，
申請(專利權)人：內江師范學院，
類型：發明
國別省市：
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