【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及熒光化合物，具體而言，涉及一種基于熒光染料酪胺的可激活信號(hào)放大檢測(cè)技術(shù)及其在核衣殼蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、酪胺信號(hào)放大(tsa)因其顯著的信號(hào)增強(qiáng)作用而被廣泛應(yīng)用于組織樣本中的抗原成像，尤其是低豐度生物標(biāo)志物。傳統(tǒng)的酪胺信號(hào)放大技術(shù)通常基于辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記的抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，大量游離熒光素酪胺(ft)在hrp催化下與蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián)，進(jìn)而使蛋白質(zhì)上共價(jià)標(biāo)記大量熒光素從而實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)放大。例如在申請(qǐng)公布號(hào)為cn103513033a，專利技術(shù)名稱為“一種基于酪胺信號(hào)放大技術(shù)和適配體識(shí)別的金黃色葡萄球菌可視化檢測(cè)方法”的專利技術(shù)專利申請(qǐng)中，同樣采用了酪胺信號(hào)放大技術(shù)。然而，該對(duì)比文件是基于適配體識(shí)別和生物素-親和素系統(tǒng)以及酪胺信號(hào)放大的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，雖能夠準(zhǔn)確識(shí)別金黃色葡萄球菌，但在傳統(tǒng)的酪胺信號(hào)放大技術(shù)策略下，熒光素酪胺處于“always?on”的狀態(tài)，導(dǎo)致背景噪音較大，不可避免地影響傳統(tǒng)tsa的準(zhǔn)確性和靈敏度，使得檢測(cè)結(jié)果的可靠性受到質(zhì)疑。
2、核衣殼蛋白是病毒結(jié)構(gòu)中的重要組成部分，例如sars-cov-2病毒的核衣殼蛋白。由于其在病毒生命周期中扮演著關(guān)鍵角色，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)于疾病的診斷和防控具有重要意義。現(xiàn)有技術(shù)中核衣殼蛋白的檢測(cè)方法多種多樣，包括一些基于免疫分析的方法。然而，核衣殼蛋白本身具有一些特點(diǎn)，例如結(jié)構(gòu)復(fù)雜、存在多種異構(gòu)體以及在樣本中的含量可能較低等，這些特點(diǎn)使得現(xiàn)有的檢測(cè)方法面臨諸多挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法往往難以在復(fù)雜的生物樣本中準(zhǔn)確識(shí)
3、因此，急需找到一種全新的基于熒光染料酪胺的可激活信號(hào)放大檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)全新的合成方法，制備得到一種全新的熒光染料酪胺。這種熒光染料酪胺具有合成方法簡(jiǎn)單、條件溫和、產(chǎn)率高的特點(diǎn)，適合大規(guī)模生產(chǎn)。并且在對(duì)sars-cov-2核衣殼蛋白的檢測(cè)中，能夠顯著降低背景噪聲，增強(qiáng)熒光信號(hào)，通過(guò)激活的熒光染料酪胺實(shí)現(xiàn)“開(kāi)啟”熒光信號(hào)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。通過(guò)在不同位點(diǎn)與待測(cè)抗原結(jié)合的多個(gè)核酸適體或抗體可顯著提高檢測(cè)特異性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)抗原的高效、準(zhǔn)確檢測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本專利技術(shù)提供一種基于熒光染料酪胺的可激活信號(hào)放大檢測(cè)技術(shù)及其在核衣殼蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用，首先通過(guò)將與核衣殼蛋白和抗體修飾的珠子孵育，使得核衣殼蛋白能夠特異性地結(jié)合在珠子表面，為后續(xù)的檢測(cè)提供了一個(gè)穩(wěn)定的基礎(chǔ)。進(jìn)而，使上述孵育后的復(fù)合物與hrp標(biāo)記的識(shí)別分子共孵育，從而形成用于檢測(cè)核衣殼蛋白的識(shí)別分子夾心結(jié)構(gòu)，所述識(shí)別分子包括核酸適體或抗體等，能夠特異性地識(shí)別核衣殼蛋白上的不同表位，所述多位點(diǎn)的特異性識(shí)別方式極大地提高了檢測(cè)的特異性。隨后加入全新合成的熒光染料酪胺和h2o2。在hrp標(biāo)記的識(shí)別分子的催化作用下，h2o2能夠激活熒光染料酪胺，使其產(chǎn)生信號(hào)放大的作用，實(shí)現(xiàn)酪胺信號(hào)的富集。所述信號(hào)放大機(jī)制基于可激活的酪胺信號(hào)放大和ros響應(yīng)的雙重放大檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)巧妙地利用熒光染料酪胺的特性以及識(shí)別分子與核衣殼蛋白的特異性結(jié)合，極大地提高了檢測(cè)靶標(biāo)的靈敏度。同時(shí)，本專利技術(shù)通過(guò)構(gòu)建不同配方進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比，以及選取多種病毒核衣殼蛋白進(jìn)行特異性驗(yàn)證試驗(yàn)，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分sars-cov-2核衣殼蛋白，顯著提高了對(duì)sars-cov-2核衣殼蛋白檢測(cè)的特異性。因此，本專利技術(shù)通過(guò)獨(dú)特的作用機(jī)制，在核衣殼蛋白檢測(cè)方面實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大、提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性，為sars-cov-2核衣殼蛋白的檢測(cè)提供了一種高效、準(zhǔn)確的方法。
2、為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用以下方案實(shí)現(xiàn)：
3、一方面，本專利技術(shù)提供一種基于熒光染料酪胺的可激活信號(hào)放大體系，其特征在于，所述可激活信號(hào)放大體系中，包括一種熒光染料酪胺，所述熒光染料酪胺只有在ros存在下，其熒光才能被激活，從而實(shí)現(xiàn)激活式的酪胺信號(hào)放大。
4、進(jìn)一步地，所述熒光染料酪胺，包括如式(i)和式(ii)所示的結(jié)構(gòu)式：
5、
6、其中，r1或r2包括氫原子、氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任意一種或多種；r3、r5或r6包括氫原子或氯原子中的任意一種或多種；r4包括氫原子、氯原子或硝基中的任意一種或多種。
7、由于傳統(tǒng)的酪胺信號(hào)放大技術(shù)存在背景噪音大、檢測(cè)靈敏度和特異性欠佳等問(wèn)題，以及核衣殼蛋白自身結(jié)構(gòu)復(fù)雜、存在多種異構(gòu)體且樣本中含量可能較低等特性導(dǎo)致檢測(cè)困難，因此本專利技術(shù)提出了一種全新的識(shí)別分子夾心結(jié)構(gòu)，并對(duì)原有的酪胺信號(hào)放大系統(tǒng)進(jìn)行了多方面優(yōu)化，形成了一種全新的基于熒光染料酪胺的可激活信號(hào)放大的檢測(cè)機(jī)制。所述機(jī)制具體如下：(1)識(shí)別分子夾心結(jié)構(gòu)：通過(guò)將核衣殼蛋白與抗體修飾的珠子孵育，使核衣殼蛋白能夠特異性地結(jié)合在珠子表面，然后與hrp標(biāo)記的識(shí)別分子(核酸適體或抗體)共孵育，形成識(shí)別分子夾心結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)利用核酸適體和抗體能夠特異性識(shí)別核衣殼蛋白上不同表位的特性，極大地提高了檢測(cè)的特異性；(2)信號(hào)放大機(jī)制：采用可激活的酪胺信號(hào)放大和ros響應(yīng)的雙重放大檢測(cè)技術(shù)。在此機(jī)制中，加入全新合成的熒光染料酪胺和h2o2，在hrp標(biāo)記的識(shí)別分子催化下，h2o2激活熒光染料酪胺，使其產(chǎn)生信號(hào)放大作用，實(shí)現(xiàn)酪胺信號(hào)的富集，從而提高了檢測(cè)靶標(biāo)的準(zhǔn)確性和靈敏度。
8、因此，在一些實(shí)施方式中，首先通過(guò)新的合成方法，合成得到全新的熒光染料酪胺，其結(jié)構(gòu)類型如式(i)和式(ii)所示。式(i)中，r1或r2為氫原子、氟原子、氯原子、溴原子或碘原子；r3、r5或r6為氫原子或氯原子；r4為氫原子、氯原子或硝基，其結(jié)構(gòu)式包括式(i-1)-式(i-6)中的任意一種。式(ii)中，r1或r2為氫原子、氟原子、氯原子、溴原子或碘原子；r3、r5或r6為氫原子或氯原子；r4為氫原子、氯原子或硝基，其結(jié)構(gòu)式包括式(ii-1)。
9、所述結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得本專利技術(shù)全新合成的熒光染料酪胺具有可激活的特性。當(dāng)存在hrp標(biāo)記的識(shí)別分子以及h2o2時(shí)，熒光染料酪胺能夠被激活，從而與核衣殼蛋白上的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián)，發(fā)揮信號(hào)放大的作用。這種可激活的特性避免了傳統(tǒng)酪胺信號(hào)放大技術(shù)中熒光素酪胺處于“always?on”狀態(tài)所導(dǎo)致的背景噪音大的缺陷。通過(guò)激活機(jī)制，只有在特定條件下熒光染料酪胺才產(chǎn)生信號(hào)，大大降低了背景噪音，提高了檢測(cè)信號(hào)的信噪比，進(jìn)而提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，為核衣殼蛋白檢測(cè)提供了一種更為可靠的方法。
10、進(jìn)一步地，所述式(i)所示的結(jié)構(gòu)式，包括如式(i-1)-式(i-6)中的任意一種：
11、
12、進(jìn)一步地，所述式(ii)所示的結(jié)構(gòu)式，包括式(ii-1)：
13、
14、在一些實(shí)施方式中，為了明確不同結(jié)構(gòu)的熒光染料酪胺對(duì)于sars-cov-2核衣殼蛋白的檢測(cè)效果，對(duì)式(i-1)-式(i-6)和式(ii-1)七種不同結(jié)構(gòu)的熒光染料酪胺在sars-cov-2核衣殼蛋白檢測(cè)中的放大效果、靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于熒光染料酪胺的可激活信號(hào)放大體系，其特征在于，所述可激活信號(hào)放大體系中，包括一種熒光染料酪胺，所述熒光染料酪胺只有在ROS存在下，其熒光才能被激活，從而實(shí)現(xiàn)激活式的酪胺信號(hào)放大。
2.如權(quán)利要求1所述的可激活信號(hào)放大體系，其特征在于，所述熒光染料酪胺，包括如式(I)或式(II)所示的結(jié)構(gòu)式：
3.如權(quán)利要求2所述的可激活信號(hào)放大體系，其特征在于，所述式(I)所示的結(jié)構(gòu)式，包括如式(I-1)-式(I-6)中的任意一種：
4.如權(quán)利要求2所述的可激活信號(hào)放大體系，其特征在于，所述式(II)所示的結(jié)構(gòu)式，包括式(II-1)：
5.一種基于可激活信號(hào)放大策略的生物分子，其特征在于，所述生物分子包括熒光染料酪胺，所述熒光染料酪胺包括權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)可激活信號(hào)放大體系中的熒光染料酪胺。
6.如權(quán)利要求5所述的生物分子，其特征在于，所述生物分子還包括特異性識(shí)別抗原的抗體、核酸適體、多肽、小分子中的任意一種或多種的組合。
7.如權(quán)利要求6所述的生物分子，其特征在于，采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記核酸適體，所述核酸適
8.一種基于熒光染料酪胺的可激活信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法通過(guò)如權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的生物分子，激活熒光染料酪胺，從而特異性識(shí)別待測(cè)抗原并實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。
9.如權(quán)利要求8所述的可激活信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括以下步驟：
10.一種熒光染料酪胺用于制備提高待測(cè)抗原檢測(cè)準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性的制劑的用途，其特征在于，所述熒光染料酪胺包括權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)可激活信號(hào)放大體系中的熒光染料酪胺。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于熒光染料酪胺的可激活信號(hào)放大體系，其特征在于，所述可激活信號(hào)放大體系中，包括一種熒光染料酪胺，所述熒光染料酪胺只有在ros存在下，其熒光才能被激活，從而實(shí)現(xiàn)激活式的酪胺信號(hào)放大。
2.如權(quán)利要求1所述的可激活信號(hào)放大體系，其特征在于，所述熒光染料酪胺，包括如式(i)或式(ii)所示的結(jié)構(gòu)式：
3.如權(quán)利要求2所述的可激活信號(hào)放大體系，其特征在于，所述式(i)所示的結(jié)構(gòu)式，包括如式(i-1)-式(i-6)中的任意一種：
4.如權(quán)利要求2所述的可激活信號(hào)放大體系，其特征在于，所述式(ii)所示的結(jié)構(gòu)式，包括式(ii-1)：
5.一種基于可激活信號(hào)放大策略的生物分子，其特征在于，所述生物分子包括熒光染料酪胺，所述熒光染料酪胺包括權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)可激活信號(hào)放大體系中的熒光染料酪胺。
6.如權(quán)利要求5所述...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李娟，彭志媛，何嘉軒，黃智勇，譚蔚泓，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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