【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及生物檢測，尤其涉及一種用于末梢血的肝素結合蛋白測定試劑盒、其制備方法及其應用。
技術介紹
1、膿毒癥和膿毒性休克仍然是重癥醫(yī)學面臨的主要的公共衛(wèi)生問題之一，及早診斷和治療是改善膿毒癥和膿毒性休克患者預后的關鍵。為了更快更準確地診治膿毒癥患者或可能進展為膿毒癥的患者，美國重癥醫(yī)學會和歐洲重癥醫(yī)學會發(fā)布了新的膿毒癥和膿毒癥休克診斷標準，用于膿毒癥診斷的序貫器官衰竭評分(sequential?organ?failureassessment,sofa)、急性生理與慢性健康狀況評分ⅱ(acute?physiology?and?chronichealth?evaluation?scoring?system,apache?ii)是icu最常用的器官衰竭評分。然而，現(xiàn)有的微生物培養(yǎng)、傳統(tǒng)感染指標，由于時間延誤、敏感性低、缺乏特異性，均不能滿足臨床及時、準確、快速診斷的需求。膿毒癥和膿毒性休克的早期準確診斷仍然具有挑戰(zhàn)性。linder等人(adam?linder?etal,critical?care?medicine,2015,43:2378-2386)的研究表明作為參與炎癥反應的肝素結合蛋白，能夠有效地預測膿毒癥以及膿毒癥休克的發(fā)生，是一個很好的臨床診斷指標。
2、酶聯(lián)免疫分析法可以準確地檢測樣品中的肝素結合蛋白濃度，但是實際操作中酶聯(lián)免疫分析(elisa)實驗耗時比較長，一般需要4至5小時才能得到檢測結果，作為預測膿毒癥及炎癥反應的重要指標，不能夠很好地滿足門診或者急診的快速檢測的需求。免疫熒光層析的方法雖然可以快速
3、肝素結合蛋白(heparin-binding?protein,hbp)又稱之為天青殺素或cap37，來源于中性粒細胞，主要儲存于嗜天青顆粒，少部分儲存于分泌小泡中，hbp是絲氨酸蛋白酶家族成員，無蛋白酶活性。對脂多糖脂質a具有高親和力。中性粒細胞活化后脫顆粒，即釋放出hbp。當發(fā)生急性細菌感染時，血液中hbp的濃度可在1-2小時內明顯升高，而病毒感染時hbp不增高或輕度增高hbp同時也作為致病因子，當患者接受有效治療后hbp濃度則很快下降。因此，檢測患者血液中hbp含量可輔助臨床進行急性細菌感染診斷及預測、感染嚴重程度判斷以及抗生素療效監(jiān)測。
4、對于監(jiān)測hbp水平的患者而言，靜脈取血并不宜重復進行，末梢血采樣方便，對人造成的傷口小，是更佳的血樣來源。但是末梢血與靜脈血的成分有較大的區(qū)別，例如一般末梢血中，紅細胞、血紅蛋白、紅細胞比容、平均紅細胞血紅蛋白含量、平均紅細胞血紅蛋白濃度、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)及中性粒細胞含量高于靜脈血。而血小板、平均紅細胞體積、淋巴細胞含量、嗜酸性粒細胞含量及嗜堿性粒細胞含量低于靜脈血。因此，雖然目前有一些hbp檢測產(chǎn)品可以針對靜脈血血清或者血漿中的hbp含量進行測定，但是這些產(chǎn)品尚不能準確檢測出末梢血液中的hbp含量。與血清、血漿、全血樣本相比、末梢血在現(xiàn)場/床旁領域的分析潛力，對膿毒癥患者的院前急救，早期篩查具有重要意義。
5、中國專利技術專利202010795512.7公開了一種hbp的磁微粒化學發(fā)光法檢測試劑盒及其制備方法對產(chǎn)品的空白限、線性范圍、鉤狀效應、特異性(膽紅素、甘油三酯、總蛋白、類風濕因子)以及與進口的elisa試劑盒的相關性進行了研究，但未對靜脈血與末梢血的一致性、相關性、回歸分析、假設檢驗等研究。末梢血的研究顯得尤為重要。
6、因此專利技術一種快速準確檢測末梢血的產(chǎn)品顯得尤為重要；建立一種定量測定末梢血中肝素結合蛋白(hbp)含量的檢測方法，可以滿足更快、更準確的預測患者是否發(fā)生膿毒癥和判別膿毒癥的嚴重程度。
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術的目的在于提供一種末梢血的肝素結合蛋白測定試劑盒、其制備方法及其應用，從而解決現(xiàn)有技術中存在的前述問題。
2、為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術采用的技術方案如下：
3、在一個方面，本專利技術提供一種用于末梢血的肝素結合蛋白測定試劑盒，包括吖啶酯標記的肝素結合蛋白(hbp)抗體、磁微粒標記的hbp抗體、預激發(fā)液、激發(fā)液、hbp系列校準品和hbp系列質控品。
4、在一些實施方案中，如下制備吖啶酯標記的hbp抗體：
5、s1.取10μl稀釋吖啶酯(nsp-dmae-nhs)母液(2.5mg/ml)，加入90μl無水dmso(或dmf)稀釋10倍，配成吖啶酯工作液(0.25mg/ml)；
6、s2.使用0.2m?nahco3(ph＝9.0)溶液稀釋50μg的hbp抗體至300μl，加入10μl吖啶酯工作液(0.25mg/ml)；
7、s3.錫箔紙包好，室溫標記0.5～1h；
8、s4.淬滅反應，加入100μl標記終止緩沖液(10％賴氨酸0.2mnahco3(ph＝9.0)溶液)，室溫混勻30分鐘；
9、s5.上述吖啶酯偶聯(lián)抗體樣本的純化
10、1)選取250ml容量的燒杯，在其中注入150ml的0.2m?ph?9.4碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，選取3.5kda截留量的透析盒并從保護袋中取出，將透析盒手持立于燒杯內底部，使液體浸沒透析盒膜；
11、2)透析盒浸泡處理同時，注射器吸取全部的吖啶酯-抗體標記體系樣本，倒置注射器排出多余空氣、彈出氣泡后，放置一旁備用；
12、3)透析盒浸泡處理結束后，取吸水紙平鋪于實驗臺面，取出上述透析盒，于吸水紙上正置和倒置輕輕敲打盒子去除多余的緩沖液，時間控制在1min以內；
13、4)將注射器針尖緩慢刺入透析盒側面進樣口，注射器反吸腔內空氣，倒置注射器排出多余空氣、彈出氣泡；
14、5)將注射器針尖緩慢刺入透析盒側面進樣口，注入全部樣本(200-500微克)后，注射器反吸腔內空氣，在保證樣本不被吸出的前提下盡量多的吸出腔內的空氣；
15、6)選擇250ml燒杯，加入樣本體積300-400倍的0.2m?ph?9.4碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，透析盒正置其中并被充分浸沒，將磁力攪拌器配套小轉子貼燒杯壁投入燒杯底部，燒杯采用避光紙?zhí)幚硭闹埽_啟磁力攪拌器，調至150-300rpm低速后，將上述燒杯置于磁力攪拌器中心位置，室溫透析0.5h；
16、7)取出透析盒，棄除燒杯中緩沖液，加入250-350倍的0.2m?ph?9.4碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，重復步驟6)室溫透析1h；
17、8)取出透析盒，棄除燒杯中緩沖液，加入200-300倍的0.2m?ph?9.4碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，重復步驟6)室溫透析2h；
18、9)取出透析盒，棄除燒杯中緩沖液，加入400-600倍的0.2m?ph?9.4碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，4℃靜置透析12-16h；
19、10)透析完畢后，棄除透析液，取出透析盒，用新的注射器插入透析盒另一側進樣口向其中注入適當空氣，將針頭放在適本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.一種用于末梢血的肝素結合蛋白測定試劑盒，包括吖啶酯標記的肝素結合蛋白(HBP)抗體、磁微粒標記的HBP抗體、預激發(fā)液、激發(fā)液、HBP系列校準品和HBP系列質控品。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其中如下制備吖啶酯標記的HBP抗體：
3.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其中通過NHS活化步驟和蛋白偶聯(lián)步驟制備磁微粒標記的HBP抗體，
4.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的試劑盒，其中所述HBP系列校準品和質控品如下制備：將重組或天然的肝素結合蛋白溶解于包含50mM?pH7.3?4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5％月桂醇聚氧乙烯醚、50mM氯化鉀、2％蔗糖、4％精氨酸和0.2％Proclin300的稀釋液中，配制成濃度分別為0、5、50、100、200、300ng/mL的校準品，以及濃度分別為8ng/mL和40ng/mL的質控品。
5.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的試劑盒，其中所述預激發(fā)液包含0.1mol/L?HNO3和0.1％H2O2，所述激發(fā)液包含0.25mol/L?NaOH和2％Triton?X-100。
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7.根據(jù)權利要求6所述所述的試劑盒，其中用于磁微粒標記的稀釋液包含0.05M?Tris、1％氯化鈉、2％BSA、4％海藻糖、0.05％Triton?X-100和0.5％Proclin300；用于HBP系列校準品和質控品的稀釋液包含50mM?pH7.3?4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.5％月桂醇聚氧乙烯醚、50mM氯化鉀、2％蔗糖、4％精氨酸和0.2％Proclin300。
8.根據(jù)權利要求6所述所述的試劑盒，其中所述緩沖液選自0.2M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH?9.4)、MES緩沖液(50mM，pH5.0)和Tris緩沖液(50mM，pH7.4)。
9.根據(jù)權利要求1-8任一所述的試劑盒在制備用于檢測患者末梢血中的HBP的產(chǎn)品中的用途。
10.根據(jù)權利要求9所述的用途，其中所述患者患有膿毒癥或膿毒癥休克。
...【技術特征摘要】
1.一種用于末梢血的肝素結合蛋白測定試劑盒，包括吖啶酯標記的肝素結合蛋白(hbp)抗體、磁微粒標記的hbp抗體、預激發(fā)液、激發(fā)液、hbp系列校準品和hbp系列質控品。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其中如下制備吖啶酯標記的hbp抗體：
3.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其中通過nhs活化步驟和蛋白偶聯(lián)步驟制備磁微粒標記的hbp抗體，
4.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的試劑盒，其中所述hbp系列校準品和質控品如下制備：將重組或天然的肝素結合蛋白溶解于包含50mm?ph7.3?4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、0.5％月桂醇聚氧乙烯醚、50mm氯化鉀、2％蔗糖、4％精氨酸和0.2％proclin300的稀釋液中，配制成濃度分別為0、5、50、100、200、300ng/ml的校準品，以及濃度分別為8ng/ml和40ng/ml的質控品。
5.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的試劑盒，其中所述預激發(fā)液包含0.1mol/l?hno3和0.1％h2o2，所述激發(fā)液包含0.2...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：王青云，李彬，耿川偉，
申請(專利權)人：山西康健恩生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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