【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于酶工程和基因工程，具體涉及一種重組ω-轉氨酶催化劑、其編碼基因及其在催化合成環(huán)己胺中的應用。
技術介紹
1、伯胺是一種常見且廣泛使用的平臺分子，在化工生產和生命科學領域都有很大的應用價值。環(huán)己胺作為伯胺的代表物質之一，在化工生產、醫(yī)藥、食品加工等領域有很大的需求量。環(huán)己胺是很多藥物合成中的關鍵中間體，如一種抗癌藥物“reversine”[1，2-(4-嗎啉苯胺基?)-n6?-環(huán)己基腺嘌呤]；環(huán)己胺的磺酸鹽，是一種常見且廉價的甜蜜素，廣泛應用與食品添加劑。隨著環(huán)己胺的下游產品的不斷開發(fā)，市場上對環(huán)己胺的需求量也在日益升高，而目前對環(huán)己胺的生產主要以硝基苯為原料還原氫化為主，條件苛刻，副產物難以處理，對環(huán)境污染嚴重，不符合綠色環(huán)保理念。
2、由于酶催化反應條件溫和、選擇性高且對環(huán)境友好，因此綠色酶法合成環(huán)己胺是未來工業(yè)的大趨勢。依賴于輔酶磷酸吡哆醛的ω-轉氨酶具有高選擇性，寬底物譜等優(yōu)良性質，成為最具吸引力的酶催化劑。但由于目前大多數(shù)野生型ω-轉氨酶在底物特異性、穩(wěn)定性、催化效率等方面存在諸多不足，無法滿足工業(yè)應用需求。因此，發(fā)現(xiàn)和改造高效的、開發(fā)穩(wěn)定的、成本低廉的轉氨酶用于催化生產環(huán)己胺，對于推動環(huán)己胺的在國內市場的發(fā)展有重大意義。
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術的目的是提供一種重組ω-轉氨酶催化劑、其編碼基因及其在催化合成環(huán)己胺中的應用，該催化劑催化合成一種高附加值的環(huán)己胺。
2、本專利技術由如下技術方案實現(xiàn)的：一種重組ω-轉氨酶催化劑，其氨基酸
3、本專利技術還提供了一種重組ω-轉氨酶基因，該基因編碼所述的重組ω-轉氨酶催化劑。
4、進一步的，其核苷酸序列如seq?id?no：2所示。
5、本專利技術還提供了包含所述重組ω-轉氨酶基因的重組載體。
6、進一步的，所述載體為大腸桿菌表達載體。
7、更進一步的，所述表達載體為pet-28a、pet-29a、pet-30a、pet-32a、pcold?i或pcold?ii中的任意一種。
8、本專利技術還提供了包含所述重組載體的重組宿主細胞，所述宿主細胞為bl21(de3)，bl21?star(de3)，bl21?(de3)?plyss，c41(de3)，c43(de3)，bl21?(de3)?plyse，origami系列、ad494?(de3)、bl21?trxb?(de3)?、shuffle?t7中的任意一種。
9、本專利技術另外還提供了包含所述重組ω-轉氨酶的酶制劑，所述酶制劑為粗酶液、粗酶粉或純酶；由如下方法制備而成：在宿主細胞中表達所述ω-轉氨酶，得到重組細胞；裂解重組細胞獲得粗酶液、粗酶粉或純酶。
10、本專利技術所述重組ω-轉氨酶催化劑在催化環(huán)己酮生成環(huán)己胺中的應用。
11、具體方法為：氨基供體為苯乙胺，氨基受體為環(huán)己酮，在所述的酶制劑和輔酶磷酸吡哆醛的催化下生成環(huán)己胺和副產物苯乙酮，反應溫度為35℃，ph=8.5的100?mmol/l的三乙醇胺緩沖液。
12、本專利技術選擇來源于惡臭假單胞桿菌屬（ pseudomonas?putida）的野生蛋白序列，通過人工設計和密碼子優(yōu)化，利用基因合成技術獲得編碼ω-轉氨酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如seq?id?no：2所示。
13、本專利技術還提供包含所述核苷酸序列的重組表達載體。如本領域中的常規(guī)質粒（pet系列），優(yōu)選的為pet-28a。在載體上通過酶切、連接等分子生物學操作，將所述核苷酸序列插入到pet-28a中，構建得到重組表達質粒，命名為pet28a-ω-ta。
14、本專利技術還提供了包含所述重組表達載體的重組宿主細胞。優(yōu)選大腸桿菌 e? .colibl21(de3)。將本專利技術第二方面中所述的重組表達質粒pet28a-ta轉化至 e?.colibl21(de3)中，獲得相應的基因工程菌 e?.colibl21?(de3)?pet28a-ta。
15、本專利技術還提供了所述ω-轉氨酶催化劑的制備方法。游離蛋白催化劑是將全細胞經超聲破碎并通過離心后獲得的粗酶液，亦包括通過蛋白純化手段獲得的純酶，亦包括由粗酶液經干燥獲得的粗酶粉。
16、本專利技術還提供了所述的轉氨酶在制備環(huán)己胺的應用。化合物的結構式如圖4所示，所述應用包括用于合成治療癌癥等關鍵醫(yī)藥中間體、食品添加劑及其各種化工合成原料。
17、本專利技術所獲得的重組轉氨酶催化劑能夠催化環(huán)己酮合成環(huán)己胺，與環(huán)己酮具有高親和力、催化效率高，改催化劑的比活力(790u/mg)比已報道的高。
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1.一種重組ω-轉氨酶催化劑，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
2.一種重組ω-轉氨酶基因，其特征在于：編碼權利要求1所述的重組ω-轉氨酶催化劑。
3.根據權利要求2所述的重組ω-轉氨酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ?IDNO：2所示。
4.包含權利要求2或3所述重組ω-轉氨酶基因的重組載體，其特征在于：所述載體為大腸桿菌表達載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述表達載體為pET-28a、pET-29a、pET-30a、pET-32a、pCold?I或pCold?II中的任意一種。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于：所述表達載體為pET-28a。
7.包含權利要求4所述重組載體的重組宿主細胞，其特征在于：所述宿主細胞為BL21(DE3)，BL21?Star(DE3)，BL21?(DE3)?pLysS，C41(DE3)，C43(DE3)，BL21?(DE3)?pLysE，Origami系列、AD494?(DE3)、BL21?Trxb?(DE3)?、S
8.根據權利要求7所述的包含重組載體的重組宿主細胞，其特征在于：所述宿主細胞為E?.coli?BL21(DE3)。
9.包含權利要求1所述重組ω-轉氨酶的酶制劑，其特征在于：所述酶制劑為粗酶液、粗酶粉或純酶；由如下方法制備而成：在宿主細胞中表達所述ω-轉氨酶，得到重組細胞；裂解重組細胞獲得粗酶液、粗酶粉或純酶。
10.權利要求1所述重組ω-轉氨酶催化劑在催化環(huán)己酮生成環(huán)己胺中的應用，其特征在于：具體方法為：氨基供體為苯乙胺，氨基受體為環(huán)己酮，在重組ω-轉氨酶和輔酶磷酸吡哆醛的催化下生成環(huán)己胺和副產物苯乙酮，反應溫度為35℃，pH=8.5的100?mmol/L的三乙醇胺緩沖液。
...【技術特征摘要】
1.一種重組ω-轉氨酶催化劑，其特征在于：其氨基酸序列如seq?id?no：1所示。
2.一種重組ω-轉氨酶基因，其特征在于：編碼權利要求1所述的重組ω-轉氨酶催化劑。
3.根據權利要求2所述的重組ω-轉氨酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如seq?idno：2所示。
4.包含權利要求2或3所述重組ω-轉氨酶基因的重組載體，其特征在于：所述載體為大腸桿菌表達載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于：所述表達載體為pet-28a、pet-29a、pet-30a、pet-32a、pcold?i或pcold?ii中的任意一種。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于：所述表達載體為pet-28a。
7.包含權利要求4所述重組載體的重組宿主細胞，其特征在于：所述宿主細胞為bl21(de3)，bl21?star(de3)，bl21?(d...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：盧靜，石亞偉，李帥，魏春華，劉青山，劉雨婷，
申請(專利權)人：山西大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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