【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥，具體涉及共表達(dá)cxcr5和il-7的嵌合抗原受體雙陰性t細(xì)胞藥物及其用途。
技術(shù)介紹
1、嵌合抗原受體t細(xì)胞(chimeric?antigen?receptor?t?cell，car-t)療法，是指通過(guò)基因工程手段在體外對(duì)t細(xì)胞進(jìn)行改造，將改造后的t細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，使其在體內(nèi)直接識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原，從而激活t細(xì)胞。激活的t細(xì)胞通過(guò)釋放穿孔素、顆粒酶素b等細(xì)胞因子直接殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還通過(guò)釋放細(xì)胞因子招募人體內(nèi)其他的內(nèi)源性免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。目前car-t細(xì)胞療法已在治療血液瘤方面取得了良好的療效，靶向bcma和cd19的car-t療法于2019年和2021年獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)。然而，由于實(shí)體瘤復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及免疫微環(huán)境問(wèn)題，car-t在治療實(shí)體瘤方面仍面臨許多挑戰(zhàn)。
2、雙陰性t細(xì)胞(dnt)是一類(lèi)cd3+cd4-cd8-的t細(xì)胞亞群，僅占人類(lèi)外周血細(xì)胞中t細(xì)胞總數(shù)的10％左右。dnt高度表達(dá)細(xì)胞表面受體，例如自然殺傷組2成員d(nkg2d)，以mhc非限制性方式特異性識(shí)別并殺死表達(dá)相應(yīng)配體的腫瘤細(xì)胞，但不會(huì)引起移植物抗宿主病和宿主抗移植物反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)異體治療。nkg2d的配體(nkg2dl)在各種腫瘤細(xì)胞的表面高表達(dá)，但在健康組織中通常低表達(dá)或不表達(dá)。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種基于nkg2d的car-t細(xì)胞療法，并取得了顯著的治療效果。因此，以dnt為基礎(chǔ)的car-t細(xì)胞治療是非常有前景的。
3、但是car-t細(xì)胞療法面臨
4、cxc趨化因子受體5(cxcr5)是g蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員，屬于cxc趨化因子受體家族。cxcr5主要表達(dá)于b細(xì)胞、t細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表面，在炎癥、感染和免疫反應(yīng)中起著重要作用。cxcl13(chemokine?c-x-cmotif?ligand?13)又稱(chēng)b細(xì)胞趨化因子，是cxcr5的配體。研究表明，cxcl13在多種腫瘤細(xì)胞表面異常表達(dá)，cxcl3/cxcr5信號(hào)軸與腫瘤的遷移和侵襲相關(guān)。
5、白細(xì)胞介素-7(interleukin-7，il-7)屬于il-2細(xì)胞因子超家族的一員，是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、胸腺基質(zhì)細(xì)胞、粘膜淋巴樣組織及角化細(xì)胞分泌的一種糖蛋白。il-7受體主要存在于骨髓細(xì)胞譜系和淋巴細(xì)胞中，還存在于il-2或有絲分裂原刺激后的nk細(xì)胞和t細(xì)胞中。il-7必須與il-7受體結(jié)合后主要激活細(xì)胞內(nèi)的jak-stat和pi3k-akt兩個(gè)信號(hào)通路，加快細(xì)胞周期，提高細(xì)胞的生存和增殖能力。
6、因此本專(zhuān)利技術(shù)旨在現(xiàn)有的靶向nkg2dl的car-dnt細(xì)胞結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上共表達(dá)cxcr5和il-7，以達(dá)到增強(qiáng)其向腫瘤部位的遷移和浸潤(rùn)能力，并且增加car-t細(xì)胞的生存和增殖能力，從而提升car-dnt細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用，達(dá)到治療腫瘤的目的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供共表達(dá)cxcr5和il-7的嵌合抗原受體雙陰性t細(xì)胞藥物及其用途，以達(dá)到增強(qiáng)其向腫瘤部位的遷移和浸潤(rùn)能力，并且增加car-t細(xì)胞的生存和增殖能力，從而提升car-dnt細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用，達(dá)到治療腫瘤的目的。
2、本專(zhuān)利技術(shù)是這樣實(shí)現(xiàn)的，共表達(dá)cxcr5和il-7的嵌合抗原受體雙陰性t細(xì)胞藥物，所述細(xì)胞藥物能夠共表達(dá)cxcr5和il-7，細(xì)胞藥物包括：依次連接的ef1-α、cd8α信號(hào)肽、nkg2d胞外段、cd8α鉸鏈區(qū)、cd8α跨膜區(qū)、共刺激分子4-1bb、cd3ζ胞內(nèi)信號(hào)區(qū)、t2a、趨化因子受體cxcr5、p2a、白細(xì)胞介素il-7；
3、所述cd8α信號(hào)肽的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述nkg2d信號(hào)肽的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，所述cd8α鉸鏈區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，所述cd8α跨膜區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no.7所示，所述共刺激分子4-1bb的核苷酸序列如seq?id?no.9所示，所述cd3ζ胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no.11所示，所述t2a的核苷酸序列如seq?id?no.13所示，所述趨化因子受體cxcr5的核苷酸序列如seq?id?no.15所示，所述p2a的核苷酸序列如seq?id?no.17所示，所述白細(xì)胞介素il-7的核苷酸序列如seq?id?no.19所示。
4、所述cd8α信號(hào)肽的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，所述nkg2d信號(hào)肽的氨基酸序列如seq?id?no.4所示，所述cd8α鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.6所示，所述cd8α跨膜區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.8所示，所述共刺激分子4-1bb的氨基酸序列如seq?id?no.10所示，所述cd3ζ胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.12所示，所述t2a的氨基酸序列如seq?id?no.14所示，所述趨化因子受體cxcr5的氨基酸序列如seq?id?no.16所示，所述p2a的氨基酸序列如seq?id?no.18所示，所述白細(xì)胞介素il-7的氨基酸序列如seq?id?no.20所示。
5、其中，所述cd8α信號(hào)肽的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
6、seq?id?no.1：
7、atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg
8、所述nkg2d信號(hào)肽的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
9、seq?id?no.3：
10、atgttattcaaccaagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttttgatgagagtaaaaactggtatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagaggaccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattccaacaaatggatcttggcagtgggaagatggctccattctctcacccaacctactaacaataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggctatatagaaaactgttcaactccaaatacatacatctgcatgcaaaggactgtg
11、所述cd8α鉸鏈區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。
12、seq?id?no.5：
13本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.共表達(dá)CXCR5和IL-7的嵌合抗原受體雙陰性T細(xì)胞藥物，其特征在于，所述細(xì)胞藥物能夠共表達(dá)CXCR5和IL-7，細(xì)胞藥物包括：依次連接的EF1-α、CD8α信號(hào)肽、NKG2D胞外段、CD8α鉸鏈區(qū)、CD8α跨膜區(qū)、共刺激分子4-1BB、CD3ζ胞內(nèi)信號(hào)區(qū)、T2A、趨化因子受體CXCR5、P2A、白細(xì)胞介素IL-7；
2.如權(quán)利要求1所述的共表達(dá)CXCR5和IL-7的嵌合抗原受體雙陰性T細(xì)胞藥物，其特征在于：所述CD8α信號(hào)肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述NKG2D信號(hào)肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，所述CD8α鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6所示，所述CD8α跨膜區(qū)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.8所示，所述共刺激分子4-1BB的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.10所示，所述CD3ζ胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.12所示，所述T2A的氨基酸序列如SEQID?NO.14所示，所述趨化因子受體CXCR5的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.16所示，所述P2A的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.18所示，所述白細(xì)胞介素
3.如權(quán)利要求1所述的共表達(dá)CXCR5和IL-7的嵌合抗原受體雙陰性T細(xì)胞藥物，其特征在于：所述共表達(dá)CXCR5和IL-7的嵌合抗原受體雙陰性T細(xì)胞藥物制備方法，包括：
4.如權(quán)利要求3所述的共表達(dá)CXCR5和IL-7的嵌合抗原受體雙陰性T細(xì)胞藥物，其特征在于：所述pLL3.7-NKG2D-CAR-CXCR5-IL-7慢病毒包裝方法，包括：
5.如權(quán)利要求3所述的共表達(dá)CXCR5和IL-7的嵌合抗原受體雙陰性T細(xì)胞藥物，其特征在于：所述CXCR5/IL-7-NKG2D-CAR-DNT細(xì)胞制備方法，包括：
6.如權(quán)利要求5所述的共表達(dá)CXCR5和IL-7的嵌合抗原受體雙陰性T細(xì)胞藥物，其特征在于：所述CXCR5/IL-7-NKG2D-CAR-DNT細(xì)胞制備方法，還包括：
7.如權(quán)利要求1-6中任一所述的共表達(dá)CXCR5和IL-7的嵌合抗原受體雙陰性T細(xì)胞藥物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
...【技術(shù)特征摘要】
1.共表達(dá)cxcr5和il-7的嵌合抗原受體雙陰性t細(xì)胞藥物，其特征在于，所述細(xì)胞藥物能夠共表達(dá)cxcr5和il-7，細(xì)胞藥物包括：依次連接的ef1-α、cd8α信號(hào)肽、nkg2d胞外段、cd8α鉸鏈區(qū)、cd8α跨膜區(qū)、共刺激分子4-1bb、cd3ζ胞內(nèi)信號(hào)區(qū)、t2a、趨化因子受體cxcr5、p2a、白細(xì)胞介素il-7；
2.如權(quán)利要求1所述的共表達(dá)cxcr5和il-7的嵌合抗原受體雙陰性t細(xì)胞藥物，其特征在于：所述cd8α信號(hào)肽的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，所述nkg2d信號(hào)肽的氨基酸序列如seq?id?no.4所示，所述cd8α鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.6所示，所述cd8α跨膜區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.8所示，所述共刺激分子4-1bb的氨基酸序列如seq?id?no.10所示，所述cd3ζ胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.12所示，所述t2a的氨基酸序列如seqid?no.14所示，所述趨化因子受體cxcr5的氨基酸序列如seq?id?no.16所示，所述p2a的氨基酸序列如...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：江文正，陳怡然，惠心慧，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：恩替蘇州生物科技有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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