【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于核酸化學領域，特別是一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法。
技術介紹
1、自人類基因組計劃完成之后，基因的序列信息已為我們所知，但我們依舊無法很好地解讀序列信息中隱藏的遺傳信息。我們已經發現核酸中存在多種不同的修飾核苷，這些修飾核苷在體內扮演著不同的生物學角色，參與眾多生物學過程，為遺傳信息的調控增加了新的層次。對這些修飾核苷的研究開辟了表觀遺傳學這一領域。當前，研究人員已能精確且定量地繪制出基因組與轉錄組中多種核苷修飾的位點，極大地推進了我們對核苷修飾在基礎生理和病理過程中功能的理解。然而，目前我們對這些核苷修飾在細胞中的空間位置信息卻不甚了解，這限制了我們對修飾核苷的研究。
2、最近，液液相分離現象與無膜細胞器的發現，表明細胞中物質的分布并非均一，不同的亞細胞定位往往與特定的生物學功能直接相關。如能獲取修飾核苷的空間信息，便可更深入的解析修飾核苷在復雜生物學背景下的動態變化和功能。然而，目前對修飾核苷的定位主要基于抗體/熒光二抗的免疫染色方法，這能夠對核苷修飾進行全局成像，但無法分辨特定核酸中的核苷修飾，難以滿足研究人員對目標核酸特定核苷修飾的功能研究的需要。如能開發一個用于原位成像特定核酸中核苷修飾的工具，將可對特定核酸中核苷修飾進行精確定位，促進研究人員對核苷修飾的研究，深化我們對核苷修飾的理解，從而更好地指導病因研究、疾病預測、新藥開發、個性醫療等眾多領域，促進醫學和生物
的發展。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供
2、本專利技術采用以下技術方案：
3、一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法包括以下步驟：
4、(1)修飾位點的單鏈核酸支架嫁接：將裝配有識別核酸特定修飾組件的單鏈核酸支架與固定、通透處理后的細胞進行孵育，或將識別核酸特定修飾的組件與通透后的細胞進行孵育后再與單鏈核酸支架孵育，從而在特定修飾位點處嫁接上單鏈核酸支架，得到處理后的細胞；
5、(2)目標核酸的識別：將能特異性靶向目標核酸序列的單鏈核酸引物-1、單鏈核酸引物-2與步驟(1)處理后的細胞進行孵育，使所述單鏈核酸引物-1和單鏈核酸引物-2與目標核酸相結合；
6、(3)信號放大：在嫁接到修飾位點的單鏈核酸支架的輔助下，單鏈核酸引物-1被連接酶環化，隨后作為單鏈核酸引物-2的引物延伸模板進行滾環擴增，對細胞內目標核酸特定修飾的信號進行原位放大；
7、(4)信號可視化：使用能與環化后的單鏈核酸引物-1相雜化的熒光探針與滾環擴增后的細胞進行孵育，滾環擴增后的產物會富集大量熒光探針，從而可在激光共聚焦顯微鏡下觀察到明顯區別于背景信號的明亮的信號點，反映目標核酸上特定修飾位點的所在亞細胞空間定位。
8、進一步地，本專利技術所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，包括單獨成像、多種核酸的同時成像、多種修飾同時成像、不同亞空間定位成像、或與蛋白免疫熒光共成像。
9、進一步地，所述的目標核酸為單鏈dna或rna。
10、進一步地，步驟(1)中所述核酸特定修飾為天然或合成的堿基修飾、核糖修飾、磷酸骨架修飾。
11、進一步地，步驟(1)中所述裝配有識別核酸特定修飾組件的單鏈核酸支架，具體包含如下組件：
12、修飾識別組件a，用于識別特定核酸修飾并與其結合；
13、單鏈核酸支架b，與單鏈核酸引物-1的首尾序列互補配對，用于協助連接酶環化單鏈核酸引物-1；
14、連接組件a，與修飾識別組件a直接結合，形成識別核酸特定修飾的組件；
15、連接組件b，與單鏈核酸支架b直接結合，形成單鏈核酸支架，與連接組件a相結合，用于將識別核酸特定修飾的組件與單鏈核酸支架相結合。
16、更進一步地，所述識別核酸特定修飾的組件與通透后的細胞進行孵育后再與單鏈核酸支架孵育，嫁接過程中，所述識別核酸特定修飾的組件和單鏈核酸支架分別包含如下組件：
17、所述識別核酸特定修飾的組件包括：修飾識別組件a，用于識別特定核酸修飾并與其結合；連接組件a，與修飾識別組件a直接結合，形成識別核酸特定修飾的組件；
18、所述單鏈核酸支架包括：單鏈核酸支架b，與單鏈核酸引物-1的首尾序列互補配對，用于協助連接酶環化單鏈核酸引物-1；連接組件b，與單鏈核酸支架b直接結合，形成單鏈核酸支架，與連接組件a相結合，用于將識別核酸特定修飾的組件與單鏈核酸支架相結合。
19、更進一步地，修飾識別組件a可以為與特定修飾非共價結合的結合蛋白或其結合結構域、抗體或抗體片段、人造蛋白、肽段，或與特定修飾共價結合的修飾酶或其催化結構域、去修飾酶或其催化結構域、天然氨基酸或其殘基、非天然氨基酸或其殘基、天然蛋白修飾或非天然蛋白修飾。
20、更進一步地，連接組件a可以為核酸結合蛋白或其結合結構域、halotag蛋白或其反應結構域、鏈霉親和素、抗體或抗體片段、天然氨基酸或其殘基、非天然氨基酸或其殘基、天然蛋白修飾或非天然蛋白修飾。
21、更進一步地，連接組件b可以為能與核酸結合蛋白或其結合結構域結合的特定核酸序列、halotag配體、生物素、能與抗體或抗體片段相結合的抗原、能與天然氨基酸或其殘基反應的特定化學基團、能與非天然氨基酸或其殘基反應的特定化學基團、能與天然蛋白修飾或非天然蛋白修飾反應的特定化學基團。
22、更進一步地，單鏈核酸支架b可以為包含或不包含核苷修飾或磷酸骨架修飾的單鏈dna、單鏈rna、單鏈lna。
23、更進一步地，在特定修飾位點裝配有識別核酸特定修飾組件的單鏈核酸支架，將識別核酸特定修飾的組件與通透后的細胞進行孵育后再與單鏈核酸支架孵育，從而在特定修飾位點處嫁接上單鏈核酸支架，具體方法為：
24、(a)構建識別核酸特定修飾的組件：設計并構建包含修飾識別組件a與連接組件a的融合蛋白表達質粒，在蛋白表達后進行純化。
25、(b)構建單鏈核酸支架：設計并固相合成包含單鏈核酸支架b與連接組件b的核酸，并進行純化，或將單鏈核酸支架b與連接組件b連接后純化。
26、(c)在特定修飾位點通過識別核酸特定修飾的組件連接單鏈核酸支架：依次將包含識別核酸特定修飾的組件的融合蛋白與包含單鏈核酸支架的核酸與細胞進行孵育，在合適的條件下在修飾位點。
27、更進一步地，將裝配有識別核酸特定修飾組件的單鏈核酸支架與固定、通透處理后的細胞進行孵育，從而在特定修飾位點處嫁接上單鏈核酸支架，具體方法為：
28、(a)構建識別核酸特定修飾的組件：設計并構建包含修飾識別組件a與連接組件a的融合蛋白表達質粒，在蛋白表達后進行純化。
29、(b)構建單鏈核酸支架：設計并固相合成包含單鏈核酸支架b與連接組件b的核酸，并進行純化。
30、(c)將步驟(a)和(b)所得產物混合,在連接本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，所述的成像包括單獨成像、多種核酸的同時成像、多種修飾同時成像、不同亞空間定位成像、或與蛋白免疫熒光共成像。
3.根據權利要求1所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，步驟(1)中，裝配有識別核酸特定修飾組件的單鏈核酸支架包含如下組件：
4.根據權利要求3所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，所述修飾識別組件為與特定修飾非共價結合的結合蛋白或其結合結構域、抗體或抗體片段、人造蛋白、肽段，或與特定修飾共價結合的修飾酶或其催化結構域、去修飾酶或其催化結構域、天然氨基酸或其殘基、非天然氨基酸或其殘基、天然蛋白修飾或非天然蛋白修飾。
5.根據權利要求3所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，所述連接組件A為核酸結合蛋白或其結合結構域、HaloTag蛋白或其反應結構域、鏈霉親
6.根據權利要求3所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，所述連接組件B為能與核酸結合蛋白或其結合結構域結合的特定核酸序列、HaloTag配體、生物素、能與抗體或抗體片段相結合的抗原、能與天然氨基酸或其殘基反應的特定化學基團、能與非天然氨基酸或其殘基反應的特定化學基團、能與天然蛋白修飾或非天然蛋白修飾反應的特定化學基團。
7.根據權利要求3所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，裝配有識別核酸特定修飾組件的單鏈核酸支架的構建方法為：
8.根據權利要求3所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，所述單鏈核酸支架包含如下組件：
9.根據權利要求1所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，步驟(2)中，單鏈核酸引物-1包含如下部分：
10.根據權利要求1所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，步驟(2)中，單鏈核酸引物-2包含如下部分：
...【技術特征摘要】
1.一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，所述的成像包括單獨成像、多種核酸的同時成像、多種修飾同時成像、不同亞空間定位成像、或與蛋白免疫熒光共成像。
3.根據權利要求1所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，步驟(1)中，裝配有識別核酸特定修飾組件的單鏈核酸支架包含如下組件：
4.根據權利要求3所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，所述修飾識別組件為與特定修飾非共價結合的結合蛋白或其結合結構域、抗體或抗體片段、人造蛋白、肽段，或與特定修飾共價結合的修飾酶或其催化結構域、去修飾酶或其催化結構域、天然氨基酸或其殘基、非天然氨基酸或其殘基、天然蛋白修飾或非天然蛋白修飾。
5.根據權利要求3所述的一種可實現細胞內目標核酸特定修飾可視化的原位成像方法，其特征在于，所述連接組件a為核酸結合蛋白或其結合結構域、halotag蛋白或其反應結構域、鏈霉親和素、抗體或抗體片段、天然氨基...
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