【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，屬于干細胞。
技術介紹
1、間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells，mscs)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，可分化為骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、肝細胞、神經細胞等多種細胞類型。mscs廣泛存在于多種組織和器官中，如骨髓、脂肪、臍帶和胎盤等。mscs在調節炎癥環境、支持神經元的發育和維持、促進血管生成和創傷愈合等方面發揮重要作用，具有廣闊的應用前景。
2、臍帶間充質干細胞(umbilical?cord?mesenchymal?stem?cells,uc-mscs)是從臍帶組織中分離得到的一類成體干細胞。uc-mscs因其易于獲取、免疫原性低、倫理爭議小等特點，近年來已被應用于再生醫學、組織工程和細胞治療等領域。然而，不同供體來源的uc-mscs在生物學特性和功能方面存在異質性，這對其臨床應用效果產生了一定影響。因此，建立一種準確、全面的檢測方法來評估不同供體來源的uc-mscs的特性具有重要意義。
3、目前，常用的mscs鑒定方法主要包括體外培養特性、表面標記物表達譜、分化潛能等。但這些方法存在一定局限性，如操作復雜、結果主觀等。
技術實現思路
1、針對上述現有技術，本專利技術提供了一種基于單細胞轉錄組測序(single?cell?rnasequencing，scrna-seq)的臍帶間充質干細胞異質性分析方法。本專利技術利用能夠在單細胞水平上對基因表
2、本專利技術是通過以下技術方案實現的：
3、一種基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，包括以下步驟：
4、(一)對臍帶間充質干細胞進行單細胞文庫制備，進行單細胞轉錄組測序，獲取每個細胞的轉錄組數據；
5、(二)利用生物信息學工具對獲得的轉錄組數據進行分析；
6、(三)根據聚類分析結果，識別uc-mscs的不同亞群，并分析各亞群的marker基因表達特征；
7、(四)基于不同亞群中的marker基因進行go富集分析，得到富集條目；
8、(五)對uc-mscs進行相關功能基因的驗證。
9、進一步地，所述步驟(一)的具體操作如下：
10、(1)使用c4_v2建庫平臺；依次將臍帶間充質干細胞的單細胞懸液、油、磁珠加入c4scrna載片，通過dnbelab?c-taim?4裝置制備成油包水液滴，在液滴中完成細胞裂解及磁珠捕獲mrna的過程；
11、(2)反轉錄生成cdna；
12、(3)向cdna中加入破乳試劑，室溫反應后離心，吸出產物，通過磁珠篩選區分oligo和cdna產物；
13、(4)配制反應體系，適溫反應一定時間，進行cdna的擴增，并純化；
14、(5)cdna產物質檢其濃度和片段分布；
15、(6)配制反應體系，適溫反應一定時間，對oligo產物進行擴增、加index并純化，待環化；
16、(7)配制反應體系，適溫反應一定時間，進行片段化、末端修復及加“a”，然后對產物進行純化；
17、(8)配制反應體系，適溫反應一定時間，進行接頭連接，然后對產物進行純化；
18、(9)配制pcr反應體系，適溫反應一定時間，進行pcr擴增，然后對產物進行純化；
19、(10)分別將cdna產物和oligo產物變性為單鏈后，分別配制環化反應體系，并設置反應程序，得到單鏈環形產物，并消化掉未被環化的線性dna分子；
20、(11)單鏈環狀dna分子通過滾環復制，形成一個包含多個拷貝的dna納米球(dnb)；將得到的dna納米球采用高密度dna納米芯片技術，加到芯片上的網狀小孔內，通過聯合探針錨定聚合技術(cpas)進行測序。
21、進一步地，所述臍帶間充質干細胞的單細胞懸液是通過以下方法制備得到的：
22、(1)將凍存有人臍帶間充質干細胞的凍存管迅速轉移到37℃水浴鍋(提前預熱半小時)中，輕柔晃動解凍，開蓋緩慢加入1ml提前預熱至37℃的完全培養基(90％dmem+10％fbs)，輕柔吸打混勻；
23、(2)將細胞轉移至9ml提前預熱至37℃的完全培養基中，輕柔顛倒混勻，4℃、300g離心5min，棄上清；
24、(3)加入3ml完全培養基清洗重懸，4℃、300g離心5min，棄上清；
25、(4)適量培養基重懸細胞，調整細胞濃度為1×106cell/ml，制成細胞懸液。
26、進一步地，所述步驟(二)中，分析包括數據預處理、質量控制、基因表達矩陣構建和/或聚類分析。
27、進一步地，所述步驟(二)、(三)、(四)中，使用dnbelab_c4scrna(v1.0.1)處理每個樣本原始的測序數據，生成原始的基因表達矩陣，然后用r包seurat(v3.2.0)進行下游分析；根據檢測到的基因數量和線粒體reads比例對細胞進行質量控制。
28、更進一步地，所述步驟(二)、(三)、(四)的具體操作如下：
29、(1)過濾掉鑒定到的基因少于200個或者大于最大基因數90％的細胞；
30、(2)將細胞按線粒體reads占比進行降序排序，過濾掉排序前15％的細胞；
31、(3)通過doublet?detection確定并刪除雙包，使用seurat(cell?cycle?scoring函數)進行細胞周期分析；
32、(4)對基因表達數據集進行標準化，隨后使用數據集中的2000個高變基因進行主成分分析(principal?component?analysis，pca)；
33、(5)用數據處理降維方法umap(uniform?manifold?approximation?andprojection)降維并聚類，對于每個簇，使用seurat包中的find?all?markers(logfc＞0.25，minpct＞0.1和padj≤0.05)函數鑒定標記基因，然后通過scsa方法注釋細胞類型；
34、(6)用find?markers(logfc＞0.25，minpct＞0.1和padj≤0.05)函數鑒定差異基因；
35、(7)用r包中的phyper函數對基因做基因本體論(gene?ontology，go)的富集分析，fdr≤0.05的go?term或者通路被認為顯著富集。
36、進一步地，所述步驟(五)中，相關功能基因為以下9個基因中的任意一個或兩個以上或全部：vcam1、f3、mcam、sdc2、本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于，所述步驟(一)的具體操作如下：
3.根據權利要求2所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于，所述臍帶間充質干細胞的單細胞懸液是通過以下方法制備得到的：
4.根據權利要求1所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于：所述步驟(二)、(三)、(四)中，使用DNBelab_C4scRNA(v1.0.1)處理每個樣本原始的測序數據，生成原始的基因表達矩陣，然后用R包Seurat(v3.2.0)進行下游分析；根據檢測到的基因數量和線粒體reads比例對細胞進行質量控制。
5.根據權利要求4所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于，所述步驟(二)、(三)、(四)的具體操作如下：
6.根據權利要求1所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于：所
7.根據權利要求1所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于，所述步驟(五)中，進行相關功能基因的驗證的具體操作如下：
8.根據權利要求1所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于，還包括步驟(六)：根據上述分析結果，建立UC-MSCs異質性數據庫。
9.一種UC-MSCs異質性數據庫，其特征在于：是利用權利要求1～8中任一項所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法建立的。
10.權利要求9所述的UC-MSCs異質性數據庫在臍帶間充質干細胞異質性分析中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于，所述步驟(一)的具體操作如下：
3.根據權利要求2所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于，所述臍帶間充質干細胞的單細胞懸液是通過以下方法制備得到的：
4.根據權利要求1所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于：所述步驟(二)、(三)、(四)中，使用dnbelab_c4scrna(v1.0.1)處理每個樣本原始的測序數據，生成原始的基因表達矩陣，然后用r包seurat(v3.2.0)進行下游分析；根據檢測到的基因數量和線粒體reads比例對細胞進行質量控制。
5.根據權利要求4所述的基于單細胞轉錄組測序的臍帶間充質干細胞異質性分析方法，其特征在于，所述步驟(二)、(三)、(四)的具體操...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊海燕，王小龍，楊志寬，白志遠，石珂，
申請(專利權)人：河南省銀豐生物工程技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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