【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物檢測化學(xué)分析，尤其涉及一種甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、作為一種由甘蔗鞭黑粉菌引起的真菌性病害，甘蔗黑穗病會造成植株生長受阻、有效莖減少、纖維含量增加、蔗糖含量降低等嚴重危害。甘蔗作為全球重要的糖料作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)直接影響到制糖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展和農(nóng)民的穩(wěn)定經(jīng)濟收益。pcr技術(shù)常用于甘蔗鞭黑粉菌基因的檢測，但設(shè)備硬件投入和檢測成本比較高，操作過程比較復(fù)雜，需要高度專業(yè)的分析人員進行實驗操作，不易在鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)村等偏遠地區(qū)進行推廣應(yīng)用。因此，開發(fā)簡易快捷、靈敏準確的甘蔗黑穗病致病菌檢測新方法，對甘蔗黑穗病的早期預(yù)警和精準管理至關(guān)重要。
2、在各種檢測模式中，光電化學(xué)法和熒光法均具有設(shè)備緊湊、操作簡單等優(yōu)勢，但在甘蔗黑穗病檢測領(lǐng)域尚未見報道。在傳感平臺中對上述兩種檢測模式進行科學(xué)組合，使其分別獲得獨立的基因含量數(shù)據(jù)，而后通過兩種模式結(jié)果的相互驗證，將有效提升檢測結(jié)果的準確性和可信度，而這樣的雙模式傳感器同樣在甘蔗黑穗病檢測領(lǐng)域未見報道。此外，甘蔗黑穗病發(fā)病早期，鞭黑粉菌基因的含量很低，需要開發(fā)簡單高效的擴增方式，以提高方法的靈敏度。在以往的無酶擴增技術(shù)報道中，催化發(fā)卡自組裝、雜交鏈式反應(yīng)等放大技術(shù)的反應(yīng)推動力源于體系的焓減反應(yīng)，還有基于體系的熵增助推信號擴增的熵驅(qū)動策略。如果理性設(shè)計信號放大體系，同時融入焓減反應(yīng)和熵增反應(yīng)，將極大加快擴增反應(yīng)的速率，從而提高傳感方法的靈敏度。目前沒有發(fā)現(xiàn)此類融合了焓減反應(yīng)和熵增反應(yīng)的擴增方式報道。
3、綜上，本專利技術(shù)目的在于提供一種甘蔗黑
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對以上不足，本專利技術(shù)提供一種甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺及其應(yīng)用，解決了現(xiàn)有傳感器在甘蔗黑穗病致病菌基因含量低時檢測準確性和靈敏度均不夠高的問題。本專利技術(shù)傳感平臺采用焓減增強的熵驅(qū)動策略，可對甘蔗黑穗病致病菌基因進行靈敏擴增和高效放大，并能分別獲取光電化學(xué)和熒光兩種檢測模式的獨立檢測結(jié)果。通過新型的擴增放大技術(shù)，以及雙模式的檢測結(jié)果相互驗證，可使檢測結(jié)果的靈敏度和準確性更高。具體技術(shù)方案如下：
2、一種甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺，所述傳感平臺是基于焓減增強的熵驅(qū)動策略構(gòu)建而成，所述傳感平臺包括：三鏈體dna和cdte?qds-nh2-f鏈；
3、所述三鏈體dna是一種由mb-a鏈和fam-b鏈組成的雙鏈；所述mb-a鏈是連接了磁珠的a鏈，所述a鏈是一種單鏈，所述a鏈的堿基序列如seq?id?no.1所示；所述fam-b鏈是修飾熒光基團的b鏈，所述b鏈是一種可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dna鏈，所述b鏈的堿基序列如seq?idno.2所示；
4、所述cdte?qds-nh2-f鏈是氨基化并連接了碲化鎘量子點的f鏈，所述f鏈是一種單鏈，所述f鏈的堿基序列如seq?id?no.3所示；
5、所述a鏈的部分堿基序列與甘蔗黑穗病致病菌基因的堿基序列互補，所述甘蔗黑穗病致病菌基因的堿基序列如seq?id?no.4所示；所述f鏈的堿基序列與所述a鏈的部分堿基序列互補，所述f鏈的部分堿基序列與所述甘蔗黑穗病致病菌基因的部分堿基序列，以及與所述b鏈的部分堿基序列相同。
6、進一步地，所述三鏈體dna的制備方法為：先將fam-b在95℃水浴下退火5min，再將mb-a(6μm，20μl)、fam-b(6μm，40μl)混合到te緩沖液(20mm?tris，100mm?nacl，50mm?mgcl2，ph?7.4)中，于35-37℃下?lián)u床反應(yīng)9-12h，最終雜交形成濃度為1-3μm的所述三鏈體dna，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
7、進一步地，所述mb-a鏈的制備方法為：先將mb(磁珠)充分振蕩混勻，用pbs(na+系)清洗3次，用適量10mm?edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺)和20mm?nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)的混合液于35-37℃下?lián)u床反應(yīng)1-2h，反應(yīng)結(jié)束用pbs清洗3次，獲得濃度為5mg·ml-1的mb溶液，即為活化后的mb溶液。在50μl活化后的mb溶液加入80μl，10μm活化后的a鏈進行混合，于35-37℃下?lián)u床反應(yīng)9-12h。
8、進一步地，所述cdte?qds-nh2-f鏈的制備方法包括以下步驟：
9、(1)cdte?qds(碲化鎘量子點)的合成：先取5mmol·l-1的cdcl2·2.5h2o和8.5mmol·l-1mpa(3-甲基丙烯酸)溶液添加到三頸燒瓶中，用1mol·l-1naoh將ph調(diào)至11-12，通n2脫氧30min，然后依次加入120mg?nabh4和0.5mmol·l-1nateo3，在n2的保護下，100℃下加熱回流6h，得到mpa包覆的cdte?qds，再加入無水乙醇，以12000rpm的速度離心收集底部的固體，通過真空干燥得到棕色的cdte?qds粉末，最后用丙酮純化后，即得；
10、(2)氨基化cdte?qds的制備：在攪拌作用下將2ml，aptes(3-氨丙基三乙氧基硅烷)分散到20ml無水乙醇中，用1mol·l-1hcl溶液調(diào)ph值至5-8，再加入cdte?qds，混合反應(yīng)30min后，在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，洗滌，得到cdte?qds-nh2；
11、(3)cdte?qds-nh2-f鏈的制備：用含有tcep(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)的te緩沖液稀釋活化后的f鏈至2μm，于35-37℃下?lián)u床反應(yīng)1-2h，得到處理后的f鏈，接著將200μl所述處理后的f鏈和0.2mg?cdte?qds-nh2混合，配成2mg·ml-1的濃度，于35-37℃下?lián)u床反應(yīng)9-12h，在4℃下保存。
12、進一步地，所述a鏈、b鏈和f鏈在使用前先進行預(yù)處理，所述預(yù)處理方法為：將所述a鏈、b鏈和f鏈分別進行離心后，分別用1×te?buffer溶解制成濃度為100μm的溶液，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
13、本專利技術(shù)還提供上述甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺的應(yīng)用，所述應(yīng)用是用于檢測目標基因是否為甘蔗黑穗病致病菌基因。
14、進一步地，所述檢測方法包括以下步驟：
15、s1.將目標基因t(target，簡稱t)進行預(yù)處理；
16、s2.將200μl三鏈體dna、cdte?qds-nh2-f鏈(2μm，200μl)和步驟s1預(yù)處理后的目標基因t(50μl，10nm)混合，于35-37℃下反應(yīng)100-120min后，用磁鐵吸引，分離出上清液與沉淀，上清液用于熒光強度測定，下層磁鐵吸引的沉淀用于光電信號測定；并進行30min、60min、90min、120min、150min、180min的反應(yīng)時間優(yōu)化；
17、s3.將所述上清液進行熒光強度測定：熒光激發(fā)波長為430nm，記錄波長范圍設(shè)置為450-700nm，每30s監(jiān)測一次熒光增強率，狹縫均設(shè)置在5nm處，檢測熒光信號變化情況；
18、s4.將所述沉淀進行光電信號檢測：將所述沉淀重新分散200μl?pbs中，本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺，其特征在于，所述傳感平臺是基于焓減增強的熵驅(qū)動策略構(gòu)建而成，所述傳感平臺包括：三鏈體DNA和CdTe?QDs-NH2-F鏈；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺，其特征在于，所述三鏈體DNA的制備方法為：先將所述FAM-B在95℃水浴下退火5min，再將所述MB-A、FAM-B混合到TE緩沖液中，于35-37℃下?lián)u床反應(yīng)9-12h，最終雜交形成濃度為1-3μM的三鏈體DNA，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺，其特征在于，所述MB-A鏈的制備方法為：先將MB充分振蕩并清洗，然后將其與EDC、NHs混合，于35-37℃下?lián)u床反應(yīng)1-2h，PBS清洗后，獲得濃度為5mg·mL-1的MB溶液，向所述濃度為5mg·mL-1的MB溶液中加入預(yù)處理后的A鏈，于35-37℃下?lián)u床反應(yīng)9-12h，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺，其特征在于，所述CdTeQDs-NH2-F鏈的制備方法包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗黑穗病...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺，其特征在于，所述傳感平臺是基于焓減增強的熵驅(qū)動策略構(gòu)建而成，所述傳感平臺包括：三鏈體dna和cdte?qds-nh2-f鏈；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺，其特征在于，所述三鏈體dna的制備方法為：先將所述fam-b在95℃水浴下退火5min，再將所述mb-a、fam-b混合到te緩沖液中，于35-37℃下?lián)u床反應(yīng)9-12h，最終雜交形成濃度為1-3μm的三鏈體dna，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺，其特征在于，所述mb-a鏈的制備方法為：先將mb充分振蕩并清洗，然后將其與edc、nhs混合，于35-37℃下?lián)u床反應(yīng)1-2h，pbs清洗后，獲得濃度為5mg·ml-1的mb溶液，向所述濃度為5mg·ml-1的mb溶液中加入預(yù)處理后的a鏈，于35-37℃下?lián)u床反應(yīng)9-12h，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗黑穗病雙模式傳感平臺，其特征在于，所述cdteqds-nh2-f鏈的制備方法包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甘蔗黑穗病雙...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：羅虎，孫緒飛，馬子龍，謝意，胡蓉，祝雪陽，黃克靖，
申請(專利權(quán))人：廣西民族大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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