【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程領域，具體涉及一種硫供體3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸累積的高產(chǎn)l-半胱氨酸工程菌及其構建方法與應用。
技術介紹
1、半胱氨酸具有兩種同分異構體，分別為l-半胱氨酸和d-半胱氨酸，具有生物活性的l-半胱氨酸是一種重要的含硫氨基酸，它能形成二硫鍵將蛋白質鏈連接成立體網(wǎng)狀結構，從而提高蛋白質的穩(wěn)定性。除此之外還有研究表明l-半胱氨酸在大腸桿菌周質空間中抵抗氧化應激具有重要作用。因此，作為一種重要的含硫氨基酸，l-半胱氨酸在食品、化妝品、藥品和動物飼料等領域得到廣泛應用。目前，l-半胱氨酸主要采用蛋白質水解法、化學合成法、酶法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，隨著l-半胱氨酸的市場空間需求量持續(xù)增加以及滿足低成本、高效益和綠色生產(chǎn)的條件來看，采用微生物發(fā)酵的方法更優(yōu)，而由于微生物體內半胱氨酸合成途徑復雜，其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)仍然存在一定挑戰(zhàn)。
技術實現(xiàn)思路
1、為了解決現(xiàn)有技術中微生物發(fā)酵合成l-半胱氨酸產(chǎn)量不高的問題，本專利技術運用理性設計和crispr-cas9基因編輯技術，提供了一種高產(chǎn)l-半胱氨酸的基因工程菌及其構建方法，以及該基因工程菌在微生物發(fā)酵制備l-半胱氨酸中的應用。
2、本專利技術采用的技術方案是：一種高產(chǎn)l-半胱氨酸工程菌的構建方法，所述方法包括：在底盤菌株中增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力；
3、其中，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括以下至少一種：
4、(1)在底盤菌中引入并過表達kluyv
5、(2)在底盤菌中引入并過表達penicillium?chrysogenum來源的n7489_009139基因；
6、(3)過表達底盤菌基因組中cysd基因。
7、請參考圖1所示的l-半胱氨酸代謝途徑圖和改造位點。本專利技術在底盤菌ssc8(e.coli?w3110，pgk/seraf/serb/serc/cysef/cysb/δsdaa/δsdab/δtdcg/δyham/δtnaa/δyciw/δgpma/δpykf/δpoxb/δmetr/eama/eambf/tolc/δydjn/δyjip-cysef/δyjir-cysef/δyeej-cysef/δycdn-cysef/δydeu-cysef/δylb?e-cysef/δyjhe-cysef，已在cn?116837015?a中公開)增強了碳通量的基礎上，為了維持菌株中碳硫平衡，綜合運用系統(tǒng)代謝工程策略，利用crispr/cas9基因編輯技術，通過基因敲入引入異源基因met3(cysd/n，編碼atp硫酸化酶)以及n7489_009139(cysc，編碼aps激酶)以增強大腸桿菌生物體內半胱氨酸合成途徑中關鍵基因表達水平(工程菌ssc8-2yj1)，同時進一步強化底盤菌基因組中cysd基因的表達以繼續(xù)增強硫通量流向l-半胱氨酸的合成，從而通過增強硫供體3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(paps)的合成能力促進產(chǎn)物合成，最終得到一株無質粒、無抗生素添加用于高產(chǎn)l-半胱氨酸的工程菌株ssc8-2yj3。
8、表1：基因編輯所涉及的基因及相應途徑
9、 基因 涉及途徑 met3 atp硫酸化酶合成 n7489_009139 aps激酶合成
10、作為優(yōu)選，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：將所述的met3基因與n7489_009139基因構建至ptrc99a質粒后轉入底盤菌中進行過表達。具體地，以工程菌ssc8為底盤菌，使用ptrc99a質粒過表達met3與n7489_009139異源基因，增強met3與n7489_009139的表達強度，得到工程菌ssc8?derivative，ptrc99a-met3-n7489_009139，記為工程菌tka1。進一步優(yōu)選，所述met3基因、n7489_009139基因均受trc啟動子調控。具體地，以工程菌ssc8為底盤菌，使用ptrc99a質粒過表達met3與n7489_009139異源基因，雙基因均使用trc啟動子調控增強基因表達強度，得到工程菌ssc8?derivative，ptrc(met3,n7489_009139)，記為工程菌tka3。
11、作為優(yōu)選，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：運用crispr-cas9介導的基因編輯技術，將所述的met3基因與n7489_009139基因替換掉底盤菌基因組上原有假基因yjhw后進行過表達。具體地，以工程菌ssc8為底盤菌，運用crispr-cas9介導的基因編輯技術，將受來源于prsfduet的met3與n7489_009139基因替換掉出發(fā)菌株基因組上原有假基因yjhw以增強met3與n7489_009139的表達強度，得到工程菌ssc8derivative，yjhw::met3-n7489_009139，記為工程菌ssc8-2yj1。
12、作為優(yōu)選，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：運用crispr-cas9介導的基因編輯技術，將底盤菌基因組中cysd基因的原位啟動子替換為trc啟動子后進行過表達。具體地，以工程菌ssc8為底盤菌，運用crispr-cas9介導的基因編輯技術，將其基因組中cysd基因原位啟動子替換為ptrc，得到工程菌ssc8?derivative，cysd::ptrc，記為工程菌ssc8-2yj2。
13、作為優(yōu)選，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：運用crispr-cas9介導的基因編輯技術，將底盤菌基因組中cysd基因的原位啟動子替換為trc啟動子后進行過表達，將所述的met3基因與n7489_009139基因替換掉底盤菌基因組上原有假基因yjhw后進行過表達。具體地，以工程菌ssc8為底盤菌，運用crispr-cas9介導的基因編輯技術，將其基因組中cysd基因原位啟動子替換為ptrc，得到工程菌ssc8?derivative，cysd::ptrc，記為工程菌ssc8-2yj2；以工程菌ssc8-2yj2為出發(fā)菌株，運用crispr-cas9介導的基因編輯技術，將受來源于ptrc99a的ptrc啟動子調控的met3與n7489_009139基因替換掉出發(fā)菌株基因組上原有假基因yjhw，增強met3與n7489_009139的表達強度，得到工程菌ssc8derivative，cysd::p本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.一種高產(chǎn)L-半胱氨酸工程菌的構建方法，其特征在于，所述方法包括：在底盤菌株中增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力；
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：運用CRISPR-Cas9介導的基因編輯技術，將底盤菌基因組中cysD基因的原位啟動子替換為Trc啟動子后進行過表達。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：運用CRISPR-Cas9介導的基因編輯技術，將所述的MET3基因與N7489_009139基因替換掉底盤菌基因組上原有假基因yjhw后進行過表達。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：將所述的MET3基因與N7489_009139基因構建至pTrc99a質粒后轉入底盤菌中進行過表達。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：運用CRISPR-Cas9介導的基因編輯技術，將底盤菌基
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述底盤菌為：E.coli?W3110，pgk/serAf/serB/serC/cysEf/cysB/ΔsdaA/ΔsdaB/ΔtdcG/Δyham/ΔtnaA/ΔyciW/ΔgpmA/ΔpykF/ΔpoxB/ΔmetR/eamA/eamBf/tolC/ΔydjN/ΔyjiP-cysEf/ΔyjiR-cysEf/ΔyeeJ-cysEf/ΔycdN-cysEf/ΔydeU-cysEf/ΔylbE-cysEf/ΔyjhE-cysEf。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述MET3基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述N7489_009139基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
8.如權利要求1～7任一所述的方法構建得到的高產(chǎn)L-半胱氨酸工程菌。
9.如權利要求8所述的高產(chǎn)L-半胱氨酸工程菌，其特征在于，為以下任意一種：
10.如權利要求8所述的高產(chǎn)L-半胱氨酸工程菌在微生物發(fā)酵制備L-半胱氨酸中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種高產(chǎn)l-半胱氨酸工程菌的構建方法，其特征在于，所述方法包括：在底盤菌株中增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力；
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：運用crispr-cas9介導的基因編輯技術，將底盤菌基因組中cysd基因的原位啟動子替換為trc啟動子后進行過表達。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：運用crispr-cas9介導的基因編輯技術，將所述的met3基因與n7489_009139基因替換掉底盤菌基因組上原有假基因yjhw后進行過表達。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：將所述的met3基因與n7489_009139基因構建至ptrc99a質粒后轉入底盤菌中進行過表達。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述增強3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸合成能力的方法包括：運用crispr-cas9介導的基因編輯技術，將底盤菌基因組中cysd基因的原位啟動子替換為trc啟動子后進行過...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：柳志強，郭玉荷，張博，鄭如意，鄭裕國，
申請(專利權)人：浙江工業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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