【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及酶工程，具體為一種高熱穩定性的腺苷激酶突變體及其應用。
技術介紹
1、腺苷酸是腺嘌呤加核糖加磷酸的化合物，是構成動物細胞核糖核酸的四種主要單核苷酸之一，腺苷酸被廣泛應用于醫藥和工業領域，常見的生產方式有四種，而目前工藝合成腺苷酸主要使用化學法，現有的腺苷酸在制備過程中有三種副產物存在，且含量占比較多，嚴重影響腺苷酸的制備純度和效率。
2、現有的酶法制備腺苷酸存在的缺陷是：
3、1、專利文件cn107602648b，公開了一種5’-腺苷酸的制備方法，主要考慮采用無溶劑合成的方法，減少反應雜質，且對環境無污染，并沒有考慮如何提高腺苷酸的產量和轉化效率；
4、2、專利文件cn105603028b，公開了酶法同時制備谷胱甘肽和腺苷酸的方法，主要考慮如何同時制備gsh和amp，并沒有考慮如何減少了其他蛋白質或雜質的干擾，能夠更有效地將腺苷轉化為腺苷酸；
5、3、專利文件cn103833813b，公開了一種基于等電溶析耦合制備腺苷酸晶體的方法，主要考慮如何制備腺苷酸晶體，在短周期內獲得純度高的產品，并沒有考慮如何提高制備過程的效率，提高產品的純度；
6、4、現有的腺苷酸制備過程中并沒有考慮如何提高篩選的效率，進而有助于提高制備腺苷酸的效率。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種高熱穩定性的腺苷激酶突變體及其應用，以解決上述
技術介紹
中提出的問題。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：一種高
3、一方面，本專利技術提供了一種高熱穩定性腺苷激酶突變體。
4、具體地，所述腺苷突變體是將seq?id?no:1所示腺苷激酶(核苷酸序列為saccharomyces?cerevisiae?s288c?chromosome:x；nc_001142.9的623581～624603序列)第253位或第82位進行突變獲得的。
5、進一步具體地，所述第253位突變為：k253r。所述第82位突變為：v82c。
6、另一方面，本專利技術提供了編碼上述腺苷激酶突變體的編碼基因。
7、再一方面，本專利技術提供了包含上述編碼基因的表達載體。
8、具體地，所述載體包括但不限于：pet28a(+)、pet30a(+)、petduet、prest或ptriex。
9、在本專利技術的某些具體實施例中，所述載體為pet28a(+)。
10、又一方面，本專利技術提供了包括上述腺苷激酶突變體和/或上述編碼基因和/或上述表達載體的基因工程菌。
11、具體地，所述基因工程菌包括但不限于大腸桿菌、沙門氏菌、畢赤酵母。
12、在本專利技術的某些具體實施例中，所述工程菌為大腸桿菌bl21(de3)。
13、又一方面，本專利技術提供了上述腺苷激酶突變體和/或上述表達載體的基因工程菌在制備腺苷酸中的應用。
14、在本專利技術的某些具體實施例中，所述基因工程菌培養后離心即可獲得濕菌體。
15、在本專利技術的某些具體實施例中，所述濕菌體超聲破碎即可獲得腺苷激酶粗酶液。
16、在本專利技術的某些具體實施例中，所述腺苷激酶的純化方式為：濕菌體用緩沖液懸浮，超聲破碎后離心，取上清，使用ni親和柱純化蛋白。
17、具體地，所述基因工程菌、濕菌體、粗酶液、腺苷激酶均能用于腺苷酸的制備。
18、又一方面，本專利技術提供了一種腺苷酸的方法。
19、具體地，所述方法以權利要求上述腺苷激酶突變體為催化劑。
20、進一步具體地，所述方法以腺苷、三磷酸腺苷二鈉、六水合氯化鎂為底物；以腺苷酸激酶、突變體腺苷激酶為催化劑，構建反應體系，一步反應合成腺苷酸。
21、在本專利技術的某些具體實施例中，所述反應體系中含20-374mm腺苷、10-226mm三磷酸腺苷二鈉、10-100mm六水合氯化鎂；所述反應體系每100ml中含腺苷酸激酶60.7-121.3u，突變體腺苷激酶16.8-33.5u。
22、具體地，所述一步反應在30-50℃下進行。
23、在本專利技術的某些具體實施例中，所述反應在40℃和50℃下進行。
24、與現有技術相比，本專利技術的有益效果是：
25、1、本專利技術通過酶催化的方式，并利用腺苷激酶突變體作為生物催化劑，用于5’-腺苷酸的酶法合成，將腺苷和三磷酸腺苷反應制得腺苷酸，在一定程度上減少了反應中的副產物和雜質生成，從而提高腺苷酸的生產效率和純度，且通過酶催化的方式制備中反應的條件溫和，不會對環境造成污染，且高熱穩定性腺苷激酶突變體應用于腺苷酸制備中，有利于提高腺苷酸制備的效率和產量。
26、2、本專利技術通過對腺苷激酶進行純化，減少了其他蛋白質或雜質的干擾，能夠更有效地將腺苷轉化為腺苷酸，減少副反應的發生，使得最終得到的腺苷酸更加純凈，在高活性的純化酶的催化下可以降低酶的使用成本，同時達到高效的催化反應，在一定程度上提高了反應效率，降低成本。
27、3、本專利技術通過對腺苷激酶的活性和熱穩定性進行測定可以有效篩選出活性差，熱穩定性差的腺苷激酶，有助于提高后續參加腺苷和三磷酸腺苷反應過程的腺苷激酶的質量，以進一步提高制備過程的效率，提高產品的純度。
28、4、本專利技術通過ark分子動力學模擬和同源蛋白多序列比對，有助于提高ark的熱穩定性，從而提高篩選的效率，進而有助于提高制備腺苷酸的效率。
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1.一種高熱穩定性的腺苷激酶突變體，其特征在于：所述高熱穩定性腺苷激酶突變體是將SEQIDNO:1所示腺苷激酶第253位或第82位進行點突變獲得的。
2.根據權利要求1所述的一種高熱穩定性的腺苷激酶突變體，其特征在于：所述第253位點突變位：K253R。
3.根據權利要求1所述的一種高熱穩定性的腺苷激酶突變體，其特征在于：所述第82位點突變位：V82C。
4.編碼權利要求1-3任一項所述腺苷激酶突變體的編碼基因。
5.一種包括權利要求4所述編碼基因的表達載體。
6.根據權利要求5所述的表達載體，其特征在于：所述表達載體基于pET28a(+)構建。
7.包括權利要求1-3任一項所述的腺苷激酶突變體權利要求4所述的編碼基因和/或權利要求5-6任一項所述的表達載體的基因工程菌。
8.根據權利要求7所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌為大腸桿菌BL21（DE3）。
9.權利要求1-3任一項所述的腺苷激酶突變體和/或權利要求4所述的編碼基因和/或權利要求5-6任一項所述的表達載體和/或權
10.一種制備腺苷酸的方法，其特征在于，所述方法以權利要求1-3任一項所述的腺苷激酶突變體和/或權利要求7-8任一項所述的基因工程菌為催化劑。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于：所述方法以腺苷、三磷酸腺苷二鈉、六水合氯化鎂為底物；以腺苷酸激酶、突變體腺苷激酶為催化劑，構建反應體系，一步反應合成腺苷酸。
12.根據根據權利要求11所述的方法，其特征在于：所述反應體系中含20-374mM腺苷、10-226mM?三磷酸腺苷二鈉、?10-100mM六水合氯化鎂。
13.根據權利要求11所述的方法，其特征在于：所述反應體系每100mL中含腺苷酸激酶60.7-121.3U，突變體腺苷激酶16.8-33.5U。
14.根據權利要求11所述的方法，其特征在于：所述一步反應在30-50℃下進行。
...【技術特征摘要】
1.一種高熱穩定性的腺苷激酶突變體，其特征在于：所述高熱穩定性腺苷激酶突變體是將seqidno:1所示腺苷激酶第253位或第82位進行點突變獲得的。
2.根據權利要求1所述的一種高熱穩定性的腺苷激酶突變體，其特征在于：所述第253位點突變位：k253r。
3.根據權利要求1所述的一種高熱穩定性的腺苷激酶突變體，其特征在于：所述第82位點突變位：v82c。
4.編碼權利要求1-3任一項所述腺苷激酶突變體的編碼基因。
5.一種包括權利要求4所述編碼基因的表達載體。
6.根據權利要求5所述的表達載體，其特征在于：所述表達載體基于pet28a(+)構建。
7.包括權利要求1-3任一項所述的腺苷激酶突變體權利要求4所述的編碼基因和/或權利要求5-6任一項所述的表達載體的基因工程菌。
8.根據權利要求7所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌為大腸桿菌bl21（de3）。
9.權利要求1-3任一項所述的腺苷...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李曉燕，韓子威，劉勝超，亢峰斌，王宏，張燕，
申請(專利權)人：杭州美亞藥業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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