【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于酶工程領域，特別涉及一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法。
技術介紹
1、酒精進入人體后，其代謝主要依賴乙醇脫氫酶(alcohol?dehydrogenase,adh)和乙醛脫氫酶(aldehyde?dehydrogenase,aldh)來完成。具體而言，酒精首先在乙醇脫氫酶的催化作用下被氧化成乙醛，乙醛進一步在乙醛脫氫酶的催化作用下被氧化為乙酸，乙酸最終被代謝為二氧化碳和水，并被排出體外。乙醇脫氫酶在不同個體中的含量及酶活性基本相當，因而酒精進入人體后被氧化為乙醛的步驟基本不受限制。人體內存在多種類型的乙醛脫氫酶，其中參與酒精代謝的主要是肝臟線粒體乙醛脫氫酶2(aldh2)。在中國以及其他亞洲國家人群中，約35-40％的個體攜帶乙醛脫氫酶2突變體。該突變體的第487位谷氨酸被賴氨酸取代，致使活性基本喪失。那些攜帶乙醛脫氫酶2突變體的人群在飲酒后，由于無法及時將乙醛清除，往往會出現臉紅、頭痛、嘔吐等癥狀，嚴重時甚至引發心血管疾病、酒精性肝病等疾病，給人體健康帶來較大損害。
2、
3、針對乙醛脫氫酶2突變體攜帶者人群，通過外源補充高活性的乙醛脫氫酶，可以彌補內源性乙醛脫氫酶活性的缺失，從根本上解決乙醛對人體的傷害。因此，乙醛脫氫酶2在解酒藥的開發領域受到極大關注。目前商業化的乙醛脫氫酶大多是從動物肝臟中提取獲得的，難以工業化大規模生產，且價格較為昂貴。為了能夠大量獲得活性乙醛脫氫酶2，研究者開始研究利用工程菌生產人源乙醛脫氫酶2。大腸桿菌具有生長快、成本低、表達水平高等優勢，然而，
技術實現思路
1、本專利技術意在提供一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，以實現從大腸桿菌系統中大量生產可溶性人源乙醛脫氫酶2。
2、本方案中的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，包括以下步驟：
3、步驟一、重組表達載體的構建：通過nde?i與xhoi限制性酶切位點將人源乙醛脫氫酶2基因插入質粒pet30a(+)中，得到的重組表達載體，命名為pet30a(+)-aldh2；
4、步驟二、重組工程菌培養：將所述重組表達載體通過熱激法轉化至大腸桿菌中進行培養，收集培養的菌體并提取質粒pet30a(+)-aldh2并測序，測序正確的菌體為重組工程菌；
5、步驟三、乙醛脫氫酶2的純化：對重組工程菌進行接種培養，然后添加終濃度為0.2～0.3mm的乳糖，于25～35℃，100r/min條件下誘導表達4～8h；誘導結束，離心收集菌體，使用緩沖液懸浮菌體，再用細胞破碎儀破碎細胞，離心收集破碎上清，得到人源乙醛脫氫酶2粗酶液，純化人源乙醛脫氫酶2粗酶液，即得所述人源乙醛脫氫酶2。
6、進一步，所述大腸桿菌選用大腸桿菌rosetta(de3)或大腸桿菌bl21(de3)。
7、進一步，將所述重組表達載體通過熱激法轉化至大腸桿菌中進行培養時，使用含有45～55μg/ml卡那青霉素的lb固體平板進行篩選；在篩選平板上挑取單克隆接種至lb液體培養基中，添加終濃度為45～55μg/ml的卡那青霉素，于35～40℃，180～220r/min的條件下培養10～15h。
8、進一步，對重組工程菌進行接種培養時，將重組工程菌接種至lb液體培養基，添加終濃度為45～55μg/ml的卡那青霉素，于35～40℃,180～220r/min的條件下培養10～15h，再轉接至新鮮lb液體培養基，添加終濃度為45～55μg/ml的卡那青霉素，于35～40℃,180～220r/min的條件下培養4～6h。
9、進一步，所述重組工程菌再轉接至新鮮lb液體培養基時，培養5.5h后添加乳糖進行誘導。
10、進一步，所述乳糖的終濃度為0.25mm。
11、進一步，所述乳糖誘導溫度為30℃。
12、進一步，所述乳糖誘導時間為6h。
13、進一步，使用鎳柱親和層析法純化人源乙醛脫氫酶2粗酶液，具體步驟如下：
14、(1)鎳柱平衡：在鎳柱中加入5倍柱體積的lysis?buffer，通過重力流出，平衡柱子；
15、(2)上樣：將所述人源乙醛脫氫酶2粗酶液加到上述平衡后的鎳柱中，重力流出；
16、(3)洗雜：在鎳柱中，加入10倍柱體積的washing?buffer(50mm?tris，300mm?nacl，30mm咪唑)，重力流出，將與鎳柱結合的雜蛋白洗出；
17、(4)洗脫：在鎳柱中，加入2倍柱體積的elution?buffer(50mm?tris，300mm?nacl，150mm咪唑)，重力流出，此時目的蛋白被置換洗出，收集此部分洗脫液；
18、(5)透析：將洗脫液轉移到14kd透析袋中，透析袋置于20mm?tris-hcl緩沖液中，透析過夜，以降低酶液中的咪唑濃度。
19、進一步，洗脫時，elution?buffer的成分為50mm?tris、300mm?nacl和150mm咪唑。
20、有益效果：
21、1、本專利借助大腸桿菌系統直接獲得可溶性的人源乙醛脫氫酶2，經純化后人源乙醛脫氫酶2的濃度達3.7mg/ml。此方法有效避免了繁瑣復雜的復性流程，同時也無需開展融合標簽的切除工作，極大地簡化了人源乙醛脫氫酶2的純化流程，使其更具有可操作性與高效性；
22、2、本專利選取廉價的乳糖作為誘導劑，誘導人源乙醛脫氫酶2基因的表達。乳糖不僅對細胞無毒性作用，而且誘導效果較iptg更佳，加之成本低廉的顯著優勢，為實現工業化大規模生產奠定了一定的基礎。
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1.一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：所述大腸桿菌選用大腸桿菌Rosetta(DE3)或大腸桿菌BL21(DE3)。
3.根據權利要求2所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：將所述重組表達載體通過熱激法轉化至大腸桿菌中進行培養時，使用含有45～55μg/mL卡那青霉素的LB固體平板進行篩選；在篩選平板上挑取單克隆接種至LB液體培養基中，添加終濃度為45～55μg/mL的卡那青霉素，于35～40℃，180～220r/min的條件下培養10～15h。
4.根據權利要求3所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：對重組工程菌進行接種培養時，將重組工程菌接種至LB液體培養基，添加終濃度為45～55μg/mL的卡那青霉素，于35～40℃,180～220r/min的條件下培養10～15h，再轉接至新鮮LB液體培養基，添加終濃度為45～55μg/mL的卡那青霉素，于35～40
5.根據權利要求4所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：所述重組工程菌再轉接至新鮮LB液體培養基時，培養5.5h后添加乳糖進行誘導。
6.根據權利要求5所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：所述乳糖的終濃度為0.25mM。
7.根據權利要求6所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：所述乳糖誘導溫度為30℃。
8.根據權利要求7所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：所述乳糖誘導時間為6h。
9.根據權利要求1～8任一項所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：使用鎳柱親和層析法純化人源乙醛脫氫酶2粗酶液，具體步驟如下：
10.根據權利要求9所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：洗脫時，Elution?buffer的成分為50mM?Tris、300mM?NaCl和150mM咪唑。
...【技術特征摘要】
1.一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：所述大腸桿菌選用大腸桿菌rosetta(de3)或大腸桿菌bl21(de3)。
3.根據權利要求2所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：將所述重組表達載體通過熱激法轉化至大腸桿菌中進行培養時，使用含有45～55μg/ml卡那青霉素的lb固體平板進行篩選；在篩選平板上挑取單克隆接種至lb液體培養基中，添加終濃度為45～55μg/ml的卡那青霉素，于35～40℃，180～220r/min的條件下培養10～15h。
4.根據權利要求3所述的一種在大腸桿菌中生產可溶性人源乙醛脫氫酶2的方法，其特征在于：對重組工程菌進行接種培養時，將重組工程菌接種至lb液體培養基，添加終濃度為45～55μg/ml的卡那青霉素，于35～40℃,180～220r/min的條件下培養10～15h，再轉接至新鮮lb液體培養基，添加終濃度為45～55μg/ml的卡那青霉素，于35...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李紅霞，冉林敏，王雄，王新葉，張璋，趙亮，
申請(專利權)人：茅臺學院，
類型：發明
國別省市：
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