【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及植物生物，具體涉及蘭科植物材料石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法。
技術(shù)介紹
1、石斛蘭（dendrobium）是蘭科（orchid）石斛屬植物，具有極高的觀賞價值和藥用價值。目前石斛蘭主流育種方法仍為雜交育種，雜交授粉的關(guān)鍵就是確定授粉親本是否親和。而花粉在柱頭上的萌發(fā)情況是授粉受精的首要一步，是我們判斷是否親本親和以及是否存在受精前障礙的關(guān)鍵，能為改善以及提高親本親和性提供思路和方向，為植物繁育學(xué)提供基礎(chǔ)性支撐。在目前石斛蘭的育種研究以及生殖生物學(xué)研究中，多集中在使用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭的可授性，以及對授粉后的結(jié)實率和種子活力等方面。比如專利號cn201610221260.0，專利技術(shù)名稱為基于花器官發(fā)育的鐵皮石斛制種法及相應(yīng)的獲得方法的專利中就提到采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定整個花期不同開花天數(shù)的小花柱頭的可授性。目前這個方法有一定效果，但是也存在一些局限性。能否有其他有效方法，是本
的人所需要考慮的。
2、普通光學(xué)顯微鏡觀察可能無法清晰地顯示花粉管的細(xì)微結(jié)構(gòu)以及萌發(fā)過程中的一些動態(tài)變化。利用熒光顯微鏡更能判定柱頭可授性和花粉管生長狀況，并且結(jié)果極為直觀準(zhǔn)確。比如申請?zhí)枮閏n202210498650.8，專利技術(shù)名稱為一種軟棗獼猴桃園授粉雄株的快速篩選方法及應(yīng)用的專利，就提出了基于胼胝質(zhì)熒光染色的授粉雄株快速篩選技術(shù)，有利于軟棗獼猴桃授粉樹的科學(xué)合理配置。但是本專利技術(shù)并未公開染色的具體方法和步驟。結(jié)合本
和本申請人的研究，傳統(tǒng)的對花的柱頭進(jìn)行熒光染色染色主要是采用直接染色和壓片觀察
3、經(jīng)申請人檢索，目前未發(fā)現(xiàn)采用熒光染色方法對石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的情況進(jìn)行觀測的專利。申請人主觀認(rèn)為，這與石斛蘭花器官較為特殊有關(guān)（見附圖1）：?1.?柱頭結(jié)構(gòu)特殊，位于合蕊柱下方，呈現(xiàn)凹槽狀；2.?柱頭體量大，微木質(zhì)化，花柱細(xì)胞組織較厚，常見石斛蘭柱頭直徑約為3-6mm，合蕊柱細(xì)胞組織較厚；3.?花粉粒聚合成立體花粉粒。因此，常規(guī)柱頭熒光染色處理對于石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的特異性和清晰度不夠理想，會出現(xiàn)以下情況：1.?花粉管生長過程被合蕊柱組織遮擋的現(xiàn)象；2.?花粉塊掉落，無法觀測花粉管；3.?壓片時使花粉塊易位，而無法觀察準(zhǔn)確的生長位置。
4、因此目前的染色方法難以準(zhǔn)確、高效地對石斛柱頭花粉萌發(fā)過程進(jìn)行研究。申請人進(jìn)行了相關(guān)技術(shù)的檢索，發(fā)現(xiàn)目前對石斛蘭柱頭熒光染色的文章僅一篇sci，且論文中染色步驟與目前常規(guī)柱頭染色步驟一致，未見報道詳細(xì)流程。因此，開發(fā)一種適用于石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，能夠清晰、準(zhǔn)確地觀察石斛蘭柱頭花粉的萌發(fā)情況，為石斛蘭以及較大型柱頭的植物材料的相關(guān)研究提供有力的技術(shù)支持。
2、本專利技術(shù)的石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法包括以下步驟：
3、步驟一：樣本采集與固定，具體是：
4、根據(jù)檢測需要，采集帶有柱頭的石斛蘭花朵，進(jìn)行預(yù)處理：去除萼片等多余部位僅保留柱頭，并將柱頭兩側(cè)修剪成水平狀，將其放入預(yù)冷的固定液中固定，然后用梯度酒精進(jìn)行脫水處理；
5、所述的固定時間為8至48小時，優(yōu)選24小時；
6、所述的固定液可采用?faa?固定液，?faa?固定液為：80%酒精?89ml、冰醋酸?6ml、福爾馬林?5ml；
7、所述梯度酒精采用濃度為?30%、50%、70%的酒精，進(jìn)行脫水處理時，每個濃度的酒精分別處理10分鐘；
8、所述的石斛蘭為鼓槌石斛時，優(yōu)先選取的柱頭直徑為5-6mm；所述的石斛蘭為鐵皮石斛時，優(yōu)先選取的柱頭直徑為1-3mm。
9、步驟二：切割，具體是：
10、將脫水后的柱頭用手術(shù)刀沿柱頭的中線切開。
11、步驟三：軟化處理切割，具體是：
12、將切開后的樣本置于軟化劑中處理使其組織軟化；
13、所述的軟化劑為4mol/l?naoh?溶液，軟化在40攝氏度下進(jìn)行，處理時間為2-3小時，使樣本組織軟化，便于后續(xù)染色操作和觀察；不同材料軟化時間不同，需要格外注意花粉塊的脫落。
14、步驟四：熒光染色，具體是：
15、將透明后的樣本轉(zhuǎn)移至含有熒光染料的染色液中，在黑暗條件下染色；
16、染色前將軟化后的樣本用無菌水清洗三次，放入0.1n磷酸緩沖液中處理，處理時間為10分鐘；
17、染色時間為8至48小時，優(yōu)選24小時；
18、所述的熒光染料選用水溶性苯胺藍(lán)，染色液濃度為0.1%。
19、步驟五：制片與觀察，具體是：
20、染色完成后，將樣本取出，將其固定在載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下，觀察石斛蘭柱頭花粉的萌發(fā)情況，包括花粉管的生長方向、長度以及花粉粒的萌發(fā)狀態(tài)等，并進(jìn)行圖像采集和分析；
21、觀察時，選擇激發(fā)光波長?350nm?和發(fā)射光波長?450nm進(jìn)行觀察；
22、固定時，用甘油將樣本固定在載玻片上制備非永久性切片；或用中性樹膠固定，制備永久性切片。
23、有益效果：1.?本專利技術(shù)的熒光染色方法能夠特異性地對石斛蘭柱頭花粉塊進(jìn)行染色，使花粉管和花粉塊在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)清晰的熒光圖像，在花粉管中還能觀察到精核，以及花粉管生長的位置和速度，便于準(zhǔn)確觀察花粉萌發(fā)的各個階段和細(xì)節(jié)。
24、2.?通過優(yōu)化固定、軟化、染色等步驟的條件，提高了染色的成功率和穩(wěn)定性，減少了花粉塊脫落而導(dǎo)致的實驗失敗概率。
25、3.?該方法操作相對簡便，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的操作流程，適用于一般實驗室開展石斛蘭生殖生物學(xué)相關(guān)研究工作，有助于推動石斛蘭育種和生殖機(jī)制研究的進(jìn)展。
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1.一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：所述的固定液采用?FAA?固定液，?FAA?固定液組分為：80%酒精?89ml、冰醋酸?6ml、福爾馬林5ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：利用固定液固定的時間為8至48小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：利用固定液固定的時間為24小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：所述的梯度酒精采用濃度為?30%、50%、70%的酒精，進(jìn)行脫水處理時，每個濃度的酒精分別處理10分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：所述的石斛蘭為鼓槌石斛時，選取的柱頭直徑為5-6mm；所述的石斛蘭為鐵皮石斛時，選取的柱頭直徑為1-3mm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：染色前
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：染色時間為24小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：觀察時，選擇激發(fā)光波長?350nm?和發(fā)射光波長?450nm進(jìn)行觀察。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：固定時，用甘油將樣本固定在載玻片上制備非永久性切片；或用中性樹膠固定，制備永久性切片。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：所述的固定液采用?faa?固定液，?faa?固定液組分為：80%酒精?89ml、冰醋酸?6ml、福爾馬林5ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：利用固定液固定的時間為8至48小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：利用固定液固定的時間為24小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斛蘭柱頭花粉萌發(fā)的熒光染色方法，其特征在于：所述的梯度酒精采用濃度為?30%、50%、70%的酒精，進(jìn)行脫水處理時，每個濃度的酒精分別處理10分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石斛蘭柱頭花粉...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李宗艷，伍倩，明珠，王明蓉，
申請(專利權(quán))人：西南林業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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