【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程和酶工程，具體涉及一種重組里氏木霉及其制備方法和應用。
技術介紹
1、公開該
技術介紹
部分的信息僅僅旨在增加對本專利技術的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。
2、啤酒廠的廢谷物啤酒糟(brewer’s?spent?grain，bsg)是啤酒釀造過程中大麥麥芽谷物糖化后產生的最豐富的副產物，約占啤酒生產過程中總副產物的85％(w/w)。bsg的結構極不均勻，包括谷殼、果皮、胚乳碎片和原始大麥籽粒的種皮，富含纖維素和半纖維素多糖、木質素以及蛋白質等，其中，纖維素占20％，半纖維素多糖占24％，木質素占20％，蛋白質約占21％。其中半纖維素多糖主要是以阿拉伯木聚糖為主，阿拉伯木聚糖的骨架是以β-(1,4)-糖苷鍵連接的d-吡喃木糖基團，其c(o)-2、c(o)-3位被α-l-阿拉伯呋喃糖基團單取代或雙取代，同時α-l-阿拉伯呋喃糖的o-5位與fa(阿魏酸，erulic?acid，化學名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)以酯鍵連接，最豐富的單糖是木糖、葡萄糖和阿拉伯糖，并且含有0.4％(w/w)的fa。
3、阿魏酰低聚糖(fos)是由fa和阿拉伯木聚糖組成，也同時具備了阿魏酸和低聚木糖的生理功能。由于親水性酯鍵的存在，使得fos更易溶于水，并且具有雙親酶性和非離子屬性，滲透能力強，fos表現出比游離fa更好的生理活性，例如抗氧化活性，抗糖基化，緩解糖尿病綜合癥，益生原作用，免疫調節，抗腫瘤功能等。廢谷物啤酒糟(bsg)的半纖維
4、目前，從bsg中提取阿魏酰低聚糖(fos)的方法主要有酸法水解、高溫蒸煮法以及生物發酵法。采用上述幾種方法提取fos時存在一些未能解決的技術問題，比如使用酸法制備的fos的食用安全性較低，并且會對環境造成一定的污染，使用高溫蒸煮法和生物發酵法則對設備要求較高，僅適用于實驗室的小規模實驗，生物發酵法依賴于發酵菌種的活性，工藝穩定性較低。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足，本專利技術的目的在于提供一種重組里氏木霉及其制備方法和應用，對草酸青霉的9種木聚糖酶基因分別構建單基因表達盒，并利用包含木聚糖酶基因的表達質粒轉化里氏木霉，實現草酸青霉來源的木聚糖酶的異源表達，并利用獲得的木聚糖酶以啤酒糟為原料制備阿魏酰低聚糖，使阿魏酰低聚糖具有高得率。
2、為了實現上述目的，本專利技術的技術方案為：
3、第一方面，一種重組里氏木霉，包含啟動子和木聚糖酶基因；
4、所述啟動子來源于里氏木霉，所述木聚糖酶基因來源于草酸青霉。
5、可選的，所述啟動子為里氏木霉的啟動子pcdna1。
6、可選的，所述木聚糖酶基因為xyn11a、xyn11b、xyn11c、xyn11d、xyn10a、xyn10b、xyn10c、xyn30a、xyn30b中的一種。
7、第二方面，上述重組里氏木霉的制備方法，包括以下步驟：
8、s1、制備里氏木霉qmp菌株的原生質體；
9、s2、制備含有目的木聚糖酶基因的重組質粒；
10、s3、利用重組質粒轉化s1中的原生質體，培養獲得重組里氏木霉菌株。
11、可選的，s2中，以pcdna1-pyrg質粒為表達載體制備重組質粒。
12、可選的，s2中，在pcdna1-pyrg質粒的pst1酶切位點進行酶切，之后將目的木聚糖酶基因插入酶切位點，從而構建含有目的基因表達盒的重組質粒。
13、可選的，s2中，以如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的m12-f/m12-r構成的引物對作為上下游引物，對重組質粒進行擴增；
14、可選的，s2中，擴增xyn11a基因的引物如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示，擴增xyn11b基因的引物如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示，擴增xyn11c基因的引物如seq?idno.7和seq?id?no.8所示，擴增xyn11d基因的引物如seq?id?no.9和seq?id?no.10所示，擴增xyn10a基因的引物如seq?id?no.11和seq?id?no.12所示，擴增xyn10b基因的引物如seqidno.13和seq?id?no.14所示，擴增xyn10c基因的引物如seq?id?no.15和seq?id?no.16所示，擴增xyn30a基因的引物如seq?id?no.17和seq?id?no.18所示，擴增xyn30b基因的引物如seq?id?no.19和seq?id?no.20所示。
15、可選的，s3中，培養轉化后的原生質體獲得單個轉化子，取單個轉化子菌落產生的孢子繼續培養，獲得重組里氏木霉菌株。
16、第三方面，上述的重組里氏木霉在生產阿魏酰低聚糖中的應用。
17、第四方面，一種生產阿魏酰低聚糖的方法，包括步驟：
18、s4、利用纖維素發酵培養基培養上述重組里氏木霉菌株，取發酵上清液提取木聚糖酶；
19、s5、以去蛋白啤酒糟為原料，添加s4中獲得的木聚糖酶，酶解獲得阿魏酰低聚糖。
20、可選的，s5中，加酶量為：木聚糖酶活與bsg的比例為(110～130)u：1g。
21、以上一個或多個技術方案存在以下有益效果：
22、纖維素生物質的結構是由纖維素、半纖維素和木質素密切纏繞而成的復雜結構，若要高效降解纖維素生物質，需要纖維素酶系(包括纖維素酶、半纖維素酶、木質素酶)的協同作用。用在里氏木霉中異源表達木聚糖酶的方式制備fos，是由于里氏木霉中特異性降解bsg產生fos的木聚糖酶含量不足。通過將不同屬種來源的木聚糖酶在里氏木霉中進行過表達，有助于篩選出高效降解bsg產生fos的木聚糖酶，此外里氏木霉是最強的纖維素酶生產者，其纖維素酶系中的纖維素酶可以將bsg中的纖維素降解，從而使得bsg中的半纖維素鏈暴露出來，有利于木聚糖酶對bsg的降解以產生更多的fos。
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1.一種重組里氏木霉，其特征在于，包含啟動子和木聚糖酶基因；
2.一種如權利要求1所述的重組里氏木霉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.如權利要求2所述的重組里氏木霉的制備方法，其特征在于，S2中，以Pcdna1-pyrG質粒為表達載體制備重組質粒。
4.如權利要求3所述的重組里氏木霉的制備方法，其特征在于，S2中，在Pcdna1-pyrG質粒的Pst1酶切位點進行酶切，之后將目的木聚糖酶基因插入酶切位點，從而構建含有目的基因表達盒的重組質粒。
5.如權利要求4所述的重組里氏木霉的制備方法，其特征在于，S2中，以如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示的M12-F/M12-R構成的引物對作為上下游引物，對重組質粒進行擴增。
6.如權利要求4所述的重組里氏木霉的制備方法，其特征在于，S2中，擴增xyn11A基因的引物如SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示，擴增xyn11B基因的引物如SEQ?ID?No.5和SEQID?No.6所示，擴增xyn11C基因的引物如SEQ?ID?No.7和SEQ
7.如權利要求2所述的重組里氏木霉的制備方法，其特征在于，S3中，培養轉化后的原生質體獲得單個轉化子，取單個轉化子菌落產生的孢子繼續培養，獲得重組里氏木霉菌株。
8.一種如權利要求1所述的重組里氏木霉在生產阿魏酰低聚糖中的應用。
9.一種生產阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，包括步驟：
10.如權利要求9所述的生產阿魏酰低聚糖的方法，其特征在于，S5中，加酶量為：木聚糖酶活與BSG的比例為(110～130)U：1g。
...【技術特征摘要】
1.一種重組里氏木霉，其特征在于，包含啟動子和木聚糖酶基因；
2.一種如權利要求1所述的重組里氏木霉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.如權利要求2所述的重組里氏木霉的制備方法，其特征在于，s2中，以pcdna1-pyrg質粒為表達載體制備重組質粒。
4.如權利要求3所述的重組里氏木霉的制備方法，其特征在于，s2中，在pcdna1-pyrg質粒的pst1酶切位點進行酶切，之后將目的木聚糖酶基因插入酶切位點，從而構建含有目的基因表達盒的重組質粒。
5.如權利要求4所述的重組里氏木霉的制備方法，其特征在于，s2中，以如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的m12-f/m12-r構成的引物對作為上下游引物，對重組質粒進行擴增。
6.如權利要求4所述的重組里氏木霉的制備方法，其特征在于，s2中，擴增xyn11a基因的引物如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示，擴增xyn11b基因的引物如seq?id?no.5和seqid?no.6所示，擴增xyn11c基因的引物如seq?id?no.7和se...
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