【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及皂皮酸等復雜三萜皂素以及中間體的生物合成，并涉及參與此生物合成的基因和多肽。
技術介紹
1、肥皂草(saponaria?officinalis，石竹科(caryophyllaceae))俗稱石堿花，是一種原產于歐洲和亞洲的多年生開花植物，一直被用作傳統的肥皂來源[1]。眾所周知，石堿花具有去污性，這得益于其植物提取物中具有高含量的兩親性皂素。古希臘人、古羅馬人及古埃及人利用石堿花提取物清潔和洗滌衣物。后來，第一批美洲殖民者將石堿花植物從歐洲帶至北美，以供家用[2]。除了去污性之外，民間醫學還一直以石堿花提取物治療梅毒、痛風、風濕病及黃疸等疾病[3]。除此之外，作為中東文化的重要一部分，石堿花提取物在中東一直用于制作芝麻醬哈爾瓦(tahini?halvah)這一傳統甜點[4]。如今，石堿花提取物仍舊被用于化妝品、保健品及植物醫藥品中[5]。另外，石堿花提取物的皂素層具有抗真菌和免疫毒性活性，因此已有研究對其作為食品表面活性劑在生物修復中的潛在用途進行探索[6～9]。
2、肥皂草富含具有皂皮酸、絲石竹苷元及絲石竹酸等各種苷元核的皂素。據報道，石堿花提取物中發現的主要皂素為肥皂草苷(saponarioside)a(spa)和肥皂草苷b(spb)[1]。spa和spb具有相似的化學結構。兩者均由c-3位以分支三糖修飾且c-28位以直鏈四糖修飾的皂皮酸苷元(c30三萜)組成。四糖鏈的首個單糖為β-d-巖藻糖，其與帶有附接乙?；摩?d-奎諾糖鍵合。spa和spb在化學上的唯一區別在于，spa的c28糖鏈的奎諾糖部
3、令人感興趣的是，qs-21這一智利皂皮樹(quillaja?saponaria)中發現的三萜皂素與spa和spb在化學上具有驚人的相似性(圖1)。qs-21為智利皂皮樹(豆目)合成的一種復雜三萜皂素。在生物化學上，qs-21由c-3位以分支三糖修飾且c-28位以直鏈四糖修飾的c30三萜皂皮酸骨架組成。四糖的末端單糖既可以為β-d-芹糖或為β-d-木糖。此外，四糖中的β-d-巖藻糖同樣具有c18?；?，該酰基鏈以阿拉伯糖糖基化。qs-21為一種強力的免疫刺激劑，能夠增強抗體反應，并提升特異性t細胞的反應，從而具有成為佐劑的巨大潛力(德爾(del)·朱迪切(giudice)等人，《免疫學研討會》(seminars?in?immunology)，2018年，39期，14～21頁；馬爾恰尼(marciani)·d·j，藥理科學趨勢(trends?inpharmacologicalsciences)，2018年，39卷，6期，573～585頁)。as01佐劑為qs-21與3-o-脫?；?4'-單磷酰脂質a的脂質體制劑，當前已被批準用于葛蘭素史克(glaxosmithkline)的帶狀皰疹疫苗shingrix以及瘧疾疫苗mosquirix中(德爾·朱迪切等人，同上)。
4、雖然肥皂草苷及其中間體具有良好的商業前景，但人們對其生物合成途徑尚一無所知。在概念上，肥皂草苷的生物合成可分為兩個階段：(i)皂皮酸核的生物合成；以及(ii)皂皮酸的修飾(圖2)。然而，植物體內的實際順序可能有所不同，更多細節尚不為人所知。很多植物天然產物在植物中的豐度較低，而且化學合成又往往因化學結構復雜而無法實現。通過了解生物合成途徑，可在替代宿主系統中進行代謝工程，從而實現目標化合物的大規模生產。
技術實現思路
1、專利技術人已識別且鑒定出石堿花(肥皂草)植物體內參與復雜三萜皂素生物合成的基因。此類基因包括：編碼參與皂皮酸生物合成的酶的基因；以及編碼參與皂皮酸糖基化的糖基轉移酶的基因。此類基因當中一種或多種的表達可用于生成皂皮酸以及皂皮酸糖基化產物。
2、本專利技術的第一方面提供一種生成三萜的方法，包括以下當中的一者或多者：
3、(i)使2,3-環氧鯊烯(os)與包括與seq?id?no：8具有至少80％序列一致性的氨基酸序列的肥皂草(saponaria?officinalis)β-香樹素合成酶(sobas)接觸，以使得2,3-環氧鯊烯轉化為β-香樹素；
4、(ii)以下兩者中的任何一者：
5、(a)使β-香樹素與包括與seq?id?no：2具有至少80％序列一致性的氨基酸序列的soc28氧化酶多肽接觸，以使得β-香樹素的c-28位氧化為羧酸，從而生成齊墩果酸，并使得齊墩果酸與包括與seq?id?no：4具有至少50％序列一致性的氨基酸序列的soc28c16氧化酶多肽接觸，以使得齊墩果酸的c-16位氧化為醇，從而生成刺囊酸；或
6、(b)使β-香樹素與包括與seq?id?no：4具有至少50％序列一致性的氨基酸序列的soc28c16氧化酶多肽接觸，以使得β-香樹素的c-28位氧化為羧酸且使
7、得β-香樹素的c-16位氧化為醇，從而生成刺囊酸；
8、(iii)使刺囊酸與包括與seq?id?no：6具有至少50％序列一致性的氨基酸序列的soc23氧化酶多肽接觸，以使得刺囊酸的c-23位氧化為醛，從而生成皂皮酸(qa)；
9、(iv)使qa與包括與seq?id?no：10具有至少60％序列一致性的氨基酸序列的肥皂草qa3-o葡萄糖醛酸轉移酶(socsl)多肽接觸，以使得qa轉化為qa-glca；
10、(v)使qa-glca與包括與seq?id?no：12具有至少50％序列一致性的氨基酸序列的肥皂草qa-glca半乳糖轉移酶(soc3gal)多肽接觸，以使得qa-glca轉化為qa-glca-gal；
11、(vi)使qa-glca-gal與包括與seq?id?no：14具有至少50％序列一致性的氨基酸序列的肥皂草qa-glca-gal木糖轉移酶(soc3xyl)多肽接觸，以使得qa-glca-gal轉化為qa-tri(qa-glca-gal-xyl)；
12、(vii)使qa-tri與包括與seq?id?no：16具有至少60％序列一致性的氨基酸序列的肥皂草qa-tri巖藻糖轉移酶(soc28fu)多肽接觸，以使得qa-tri轉化為qa-trif；
13、(viii)使qa-trif與包括與seq?id?no：18具有至少50％序列一致性的氨基酸序列的肥皂草qa-trif鼠李糖轉移酶(soc28rha)多肽接觸，以使得qa-trif轉化為qa-trifr；
14、(ix)使qa-trifr與包括與seq?id?no：20具有至少50％序列一致性的氨基酸序列的肥皂草qa-trifr木糖轉移酶(soc28xyl1)多肽接觸，以使得qa-trifr轉化為qa-trifrx；以及/或者
15、(x)使qa-trifrx與包括與seq?id?no：22具有至少50％序列一致性的氨基酸序列的肥皂草qa-trifrx木糖轉移酶(soc28xyl2)多肽接觸，以使得qa-trifrx轉化為qa-trifrxx；
16、(x本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種生成三萜的方法，包括：
2.根據權利要求1所述的方法，包括：
3.根據權利要求2所述的方法，其中，β-香樹素通過如下方式生成：使2,3-環氧鯊烯(OS)與具有與SEQ?ID?NO：8具有至少80％序列一致性的氨基酸序列的β-香樹素合成酶(SobAS)接觸，以將所述2,3-環氧鯊烯環化，從而生成β-香樹素。
4.根據權利要求2或權利要求3所述的方法，進一步包括：
5.根據權利要求4所述的方法，進一步包括：
6.根據權利要求5所述的方法，進一步包括：
7.一種將宿主從所述宿主無法自2,3-環氧鯊烯(OS)進行三萜生物合成的表型轉化成所述宿主能夠進行所述三萜生物合成的表型的方法，所述方法包括：
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述異源核酸編碼以下多肽：
9.根據權利要求8所述的方法，其中，所述異源核酸進一步編碼將2,3-環氧鯊烯環化為三萜的肥皂草β-香樹素合成酶(SobAS)，所述SobAS與SEQ?ID?NO：8具有至少80％的序列一致性。
10.根據權利要求8或權
11.根據權利要求10所述的方法，其中，所述異源核酸進一步編碼以下多肽：
12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述異源核酸進一步編碼以下多肽：
13.一種包含異源核酸或以異源核酸轉化的宿主細胞，所述異源核酸包括多種核苷酸序列，每一核苷酸序列編碼一多肽，這些多肽組合具有三萜生物合成活性，
14.根據權利要求13所述的宿主細胞，其中，所述多種核苷酸序列編碼以下多肽：
15.根據權利要求14所述的宿主細胞，其中，所述異源核酸進一步編碼將2,3-環氧鯊烯環化為三萜的肥皂草β-香樹素合成酶(SobAS)，所述SobAS與SEQ?ID?NO：8具有至少80％的序列一致性。
16.根據權利要求14或權利要求15所述的宿主細胞，其中，所述異源核酸進一步編碼以下多肽：
17.根據權利要求16所述的宿主細胞，其中，所述異源核酸進一步編碼以下多肽中的一者、兩者、三者或所有四者：
18.根據權利要求17所述的宿主細胞，其中，所述異源核酸進一步編碼以下多肽中的一者或所有兩者：
19.一種分離的多肽，包括：
20.一種編碼根據權利要求19所述的一種或多種多肽的分離的核酸。
21.一種包括根據權利要求20所述的核酸的載體。
22.一種包括根據權利要求20所述的核酸或根據權利要求21所述的載體的宿主細胞。
23.一種生成宿主細胞的方法，包括：以異源核酸轉化或轉染宿主細胞，所述異源核酸包括多種根據權利要求7～18以及20當中任何一項所述的核苷酸序列。
24.根據權利要求23所述的方法，其中，所述宿主細胞為植物細胞。
25.一種生成轉基因植物的方法，所述方法包括如下步驟：
26.一種轉基因植物，所述轉基因植物可通過如權利要求25所述的方法獲得，或者為所述轉基因植物的克隆，或自交或雜交子代或其他后代，
27.一種在異源宿主體內生成三萜的方法，所述方法包括：培養如權利要求13～18以及22當中任何一項所述的宿主細胞，以及純化自其而得的所述三萜。
28.一種在異源宿主體內生成三萜的方法，所述方法包括：使根據權利要求26所述的植物生長，然后將其收獲，并純化自其而得的所述三萜。
29.根據權利要求27或28所述的方法，其中，所述三萜為皂皮酸或糖基化皂皮酸。
30.根據權利要求29所述的方法，其中，所述糖基化皂皮酸為QA-Tri、QA-TriFRXX或QA-TriF(Q-Ac)RXX。
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種生成三萜的方法，包括：
2.根據權利要求1所述的方法，包括：
3.根據權利要求2所述的方法，其中，β-香樹素通過如下方式生成：使2,3-環氧鯊烯(os)與具有與seq?id?no：8具有至少80％序列一致性的氨基酸序列的β-香樹素合成酶(sobas)接觸，以將所述2,3-環氧鯊烯環化，從而生成β-香樹素。
4.根據權利要求2或權利要求3所述的方法，進一步包括：
5.根據權利要求4所述的方法，進一步包括：
6.根據權利要求5所述的方法，進一步包括：
7.一種將宿主從所述宿主無法自2,3-環氧鯊烯(os)進行三萜生物合成的表型轉化成所述宿主能夠進行所述三萜生物合成的表型的方法，所述方法包括：
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述異源核酸編碼以下多肽：
9.根據權利要求8所述的方法，其中，所述異源核酸進一步編碼將2,3-環氧鯊烯環化為三萜的肥皂草β-香樹素合成酶(sobas)，所述sobas與seq?id?no：8具有至少80％的序列一致性。
10.根據權利要求8或權利要求9所述的方法，其中，所述異源核酸進一步編碼以下多肽：
11.根據權利要求10所述的方法，其中，所述異源核酸進一步編碼以下多肽：
12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述異源核酸進一步編碼以下多肽：
13.一種包含異源核酸或以異源核酸轉化的宿主細胞，所述異源核酸包括多種核苷酸序列，每一核苷酸序列編碼一多肽，這些多肽組合具有三萜生物合成活性，
14.根據權利要求13所述的宿主細胞，其中，所述多種核苷酸序列編碼以下多肽：
15.根據權利要求14所述的宿主細胞，其中，所述異源核酸進一步編碼將2,3-環氧鯊烯環化為三萜的肥皂草β-香樹素合成酶(sobas)，所述sobas與s...
【專利技術屬性】
技術研發人員：安妮·奧斯本，秀賢·趙，
申請(專利權)人：植物生物科學有限公司，
類型：發明
國別省市：
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