【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于微生物，尤其涉及一種土壤中抗氧化活性細(xì)菌的快速篩選方法。
技術(shù)介紹
1、守護(hù)人類健康需要解決機(jī)體氧化應(yīng)激和氧化炎癥的問(wèn)題。氧化應(yīng)激指活性氧簇(ros)的產(chǎn)生量超出了細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，引發(fā)炎癥及多種慢性疾病，如糖尿病、癌癥等。
2、抗氧化劑能清除ros，修復(fù)細(xì)胞損傷，但人體內(nèi)源性防御已顯不足，外源性抗氧化劑的補(bǔ)充尤為必要。然而常用的抗氧化劑如維生素c(vc)、維生素e(ve)長(zhǎng)期使用有副作用。因此，尋找低成本、綠色、安全的天然替代品是全球趨勢(shì)。
3、自古以來(lái)，藥用動(dòng)植物是抗氧化劑主要來(lái)源。但受季節(jié)、地理環(huán)境或保護(hù)性質(zhì)的限制，使得大量提取抗氧化活性物質(zhì)變得困難。相比動(dòng)植物，微生物在受控條件下能迅速生長(zhǎng)，在抗氧化活性物種的生產(chǎn)上具有更大的優(yōu)勢(shì)。此外，與合成抗氧化劑相比，微生物源抗氧化劑無(wú)毒、無(wú)致癌風(fēng)險(xiǎn)，可生物降解，更安全環(huán)保，開發(fā)與應(yīng)用價(jià)值巨大。
4、獲得微生物產(chǎn)物的前提是篩選得到目標(biāo)微生物，但微生物的傳統(tǒng)篩選法存在兩大問(wèn)題：一、低豐度或慢生長(zhǎng)微生物易被忽略；二、培養(yǎng)基與原生環(huán)境差異致微生物可能進(jìn)入低代謝狀態(tài)。雖可將單菌落用含指示劑的培養(yǎng)基篩選，但未根本解決低豐度問(wèn)題，且過(guò)程耗時(shí)耗力。同時(shí)，目前尚未見有土壤抗氧化活性菌株的快速篩選方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)提供了一種土壤中抗氧化活性細(xì)菌的快速篩選方法。該方法篩選效率高，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高，操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)節(jié)約，是一種理想的篩選方法。
2、本專利技術(shù)提供一種土
3、s1、摸索土壤浸出液的前處理方法，致力于盡可能多的保留土壤中的細(xì)菌。
4、進(jìn)一步地，步驟s1中，需要消除土壤浸出液中土壤顆粒和還原性代謝成分對(duì)后續(xù)氧化脅迫實(shí)驗(yàn)的干擾。
5、進(jìn)一步地，步驟s1中，前處理方法居于離心處理和過(guò)濾處理兩種常用方法設(shè)計(jì)。
6、進(jìn)一步地，步驟s1中，選擇保留土壤細(xì)菌量最多前處理組的土壤菌懸液進(jìn)行后續(xù)的氧化脅迫實(shí)驗(yàn)。
7、s2、探究高效氧化方法，旨在短時(shí)間、最大限度地消滅不具有抗氧化能力細(xì)菌，留下高抗氧化活性的菌株。
8、進(jìn)一步地，步驟s2中，盡可能讓更多的土壤細(xì)菌直接面對(duì)氧化脅迫。
9、進(jìn)一步地，步驟s2中，通過(guò)統(tǒng)計(jì)土壤菌懸液在不同h2o2氧化脅迫濃度和脅迫時(shí)間處理后能存活的細(xì)菌數(shù)量(500-2000cfu/g)，來(lái)確定最適宜的氧化脅迫處理方法。
10、進(jìn)一步地，步驟s2中，根據(jù)s1確定的最佳前處理方法制備土壤菌懸液并濃縮至一半，1：1加入h2o2溶液(0.2、2、20、50、100、150、200、250、300、350、400、1000mm)，使h2o2的最終濃度分別為0.1、1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、500mm，振蕩混勻后即得樣液。將樣液置于37℃下氧化脅迫不同時(shí)間(15，30，60min)后取樣涂布，平板菌落計(jì)數(shù)。
11、s3、將最適宜氧化脅迫處理方法獲得的所有細(xì)菌進(jìn)行分離純化并制備菌液，通過(guò)體外抗氧化指標(biāo)的測(cè)定來(lái)判斷該菌株是否具有抗氧化活性。
12、進(jìn)一步地，步驟s3中，將菌液分別采用dpph自由基清除法、羥自由基清除法和鐵離子還原法來(lái)測(cè)定其抗氧化活性，同時(shí)設(shè)置牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，通過(guò)比較和分析不同方法下菌液吸光值的變化，來(lái)判斷該菌株是否具有抗氧化活性。
13、s4、未經(jīng)氧化脅迫處理過(guò)的土壤細(xì)菌的分離純化及菌液制備流程、抗氧化活性的測(cè)定方法同s3。通過(guò)s3與s4中具抗氧化能力的細(xì)菌數(shù)量和抗氧化活性的對(duì)比，驗(yàn)證所建立的土壤中抗氧化活性細(xì)菌的快速篩選方法是否成功。判斷標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)過(guò)氧化脅迫處理的細(xì)菌有更多具抗氧化能力的細(xì)菌數(shù)量，且抗氧化活性更高。
14、進(jìn)一步地，步驟s3、s4中，細(xì)菌的菌液制備流程如下：細(xì)菌菌落接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，調(diào)整菌液od600值至1后，以5000rpm離心5min，收集上清液。
15、本專利技術(shù)的具體方法為：
16、將200g土壤樣品與1800ml無(wú)菌生理鹽水混合，使用玻棒連續(xù)攪拌5min后，靜置5min，取上清液即為土壤浸出液；土壤浸出液以300rpm離心0.5min，取上清，以5000rpm離心5min，棄上請(qǐng)；沉淀用900ml無(wú)菌生理鹽水懸浮，即為土壤菌懸液；將土壤菌懸液與200mmh2o2氧化劑按1：1的比例混合，于37℃下分別培養(yǎng)30min(測(cè)定dpph自由基清除能力與鐵離子還原能力)或60min(測(cè)定羥自由基清除率)，分別取200μl涂布至90mm牛肉膏蛋白胨固體平面培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)36h，挑取單菌落劃線分離培養(yǎng)，即可獲得具有高抗氧化活性菌株的純培養(yǎng)。
17、本專利技術(shù)的有益效果為：
18、1.該方法篩選效率高，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求不高，操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)節(jié)約，是一種理想的篩選方法。
19、2.該方法的建立，不僅能極大提高抗氧化活性細(xì)菌的篩選效率，服務(wù)于天然抗氧化劑的開發(fā)，還能為其他微生物的篩選提供參考。
20、值得注意的是，不同的篩選目的都需要再確定具體的篩選參數(shù)，未來(lái)微生物功能菌株的篩選需要更多的標(biāo)準(zhǔn)菌株篩選方法。
本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種土壤中抗氧化活性細(xì)菌的快速篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤中抗氧化活性細(xì)菌的快速篩選方法，其特征在于：步驟S1中，土壤浸出液的制備方法為：采集表層(0-10cm)土壤，過(guò)10-100目篩去除大顆粒雜質(zhì)，稱取土壤樣本1-1000份，放入燒杯中，根據(jù)V土壤樣本:V生理鹽水＝1:9的體系加入生理鹽水。使用玻棒連續(xù)攪拌1-10min，靜置1-30min，取上清液即得土壤浸出液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤中抗氧化活性細(xì)菌的快速篩選方法，其特征在于：步驟S2中，土壤菌懸液制備的方法為：土壤浸出液以300rpm離心0.5min，取上清，再5000rpm離心5min，棄上請(qǐng)；沉淀用無(wú)菌生理鹽水按離心前的體積懸浮，即為土壤菌懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤中抗氧化活性細(xì)菌的快速篩選方法，其特征在于：步驟S3中，氧化劑處理土壤菌懸液的方式需要根據(jù)需要開發(fā)的抗氧化菌株的特性進(jìn)行調(diào)整。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的氧化劑處理土壤菌懸液的方式，具體操作為：開發(fā)DPPH、羥自由基、FRAP指標(biāo)作用的代謝
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種土壤中抗氧化活性細(xì)菌的快速篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤中抗氧化活性細(xì)菌的快速篩選方法，其特征在于：步驟s1中，土壤浸出液的制備方法為：采集表層(0-10cm)土壤，過(guò)10-100目篩去除大顆粒雜質(zhì)，稱取土壤樣本1-1000份，放入燒杯中，根據(jù)v土壤樣本:v生理鹽水＝1:9的體系加入生理鹽水。使用玻棒連續(xù)攪拌1-10min，靜置1-30min，取上清液即得土壤浸出液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤中抗氧化活性細(xì)菌的快速篩選方法，其特征在于：步驟s2中，土壤菌懸液制備的方法為：土壤浸出液以300rpm離心0.5mi...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：肖文，楊曉燕，佘容，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：大理大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒(méi)有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。