【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物化學及分子生物學領域，具體涉及一種mir-122靶標基因sgiv163缺失的重組新加坡石斑魚虹彩病毒的構建方法及應用。
技術介紹
1、石斑魚是中國南方沿海以及東南亞各國重要且名貴的經濟海水養殖魚類，因其肉質鮮美，營養價值豐富，深受廣大消費者的追捧。然而，集約化養殖以及管理方式缺乏，導致石斑魚的病害頻發，不僅給該產業造成了嚴重的損失，而且嚴重制約了石斑魚養殖的可持續發展。新加坡石斑魚虹彩病毒(sgiv)是qin等在2003年從新加坡患病石斑魚脾臟中分離出的一株高致病性虹彩病毒，患病魚體主要病癥為魚體脾臟出血和腫大，并且感染一周內石斑魚的死亡率高于90％。由于該病毒具有極易感染性和極高的致死率，因此尋求一種高效的防治方法迫在眉睫。
2、目前已有的水生動物dna病毒載體系統均存在不同程度的缺陷，主要表現為構建步驟繁瑣，耗時過長或者效率低下，有些在重組病毒中引入了不必要的外源序列，給后續研究帶來了不同程度的影響。傳統意義上對水生動物dna病毒的構建主要是利用同源重組法配合有效梯度篩選法進行構建，或者利用乳糖操縱子對某個病毒基因進行表達限制，從而降低了該病毒基因的表達以達到重組病毒的效果。然而同源重組法配合有效梯度篩選法進行構建往往會引入一個外源的藥物抗性基因，利用該抗藥性基因進行篩選，同源重組載體構建繁瑣，并且有效梯度篩選法效率低下。乳糖操縱子雖然對特定病毒基因的表達形成了抑制作用，但是抑制作用并不特別顯著。并且近年來，不同的水生dna病毒新的生物特性不斷被發現，因此，本領域對構建過程更加方便快捷，高效靈活
3、micrornas(mirnas)是一類長約18-25個核苷酸的小分子非編碼rna，通過與靶基因序列互補結合，在轉錄后參與基因的表達調控。目前關于mirna對sgiv病毒功能上的影響僅存在于對機體上的驗證，對于mirna是如何對sgiv直接作用的機理尚不明確。據報道，mir-122能夠在體外促進sgiv病毒的復制，并且能夠抑制sgiv在體外誘導的細胞凋亡，并且mir-122在sgiv感染機體時能夠抑制體內炎癥因子表達，然而mir-122是如何直接作用于sgiv的機理尚不明確。
技術實現思路
1、本專利技術的第一個目的是提供一種新加坡石斑魚虹彩病毒sgiv163基因，其核苷酸序列如seq?id?no.5所示。
2、本專利技術的第二個目的是提供sgiv163基因缺失在降低新加坡石斑魚虹彩病毒復制能力中的應用。
3、本專利技術的第三個目的是提供sgiv163基因缺失在抑制石斑魚mir-122提升sgiv病毒蛋白mcp表達中的應用。
4、本專利技術的第四個目的是提供一種誘導sgiv163基因缺失的重組病毒載體質粒，其包括sgiv病毒基因片段sgiv162l、綠色熒光蛋白基因egfp、sgiv病毒icp18啟動子和sgiv病毒基因片段sgiv1，所述sgiv162l的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述egfp的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述icp18啟動子的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，所述sgiv1的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
5、優選地，為seq?id?no.1-4所示的核苷酸序列依次相連插入pdsred2-c1載體。
6、本專利技術的第五個目的是提供一種mir-122靶標基因sgiv163缺失的重組新加坡石斑魚虹彩病毒的構建方法，其包括如下步驟：將上述的重組病毒載體質粒轉染gs或fhm細胞，與新加坡石斑魚虹彩病毒液混合孵育，收集存在綠色熒光的細胞，即得sgiv163缺失的重組新加坡石斑魚虹彩病毒。
7、優選地，具體步驟如下：
8、(1)設計引物，如表1所示：
9、表1引物序列
10、
11、(2)獲得擴增模板：
12、病毒基因擴增模板來源于含有sgiv感染的細胞，對被病毒感染的細胞進行總rna提取，然后將提取純化后的rna逆轉錄獲得的cdna作為模板，綠色熒光基因模板來源于質粒pe?gfp-c1；
13、(3)目的基因擴增及雙酶切：
14、把步驟(1)中的引物和(2)中的模板進行聚合酶鏈式反應擴增，純化，得到擴增產物；然后通過內切酶xhoi和bamhi將所獲得的重組基因以及pdsred2-c1進行雙酶切，并且將酶切片段進行回收純化；
15、(4)重組片段連接及轉化：
16、使用t4dna連接酶將酶切片段進行連接，最后將連接片段轉化至感受態大腸桿菌細胞；將含有重組片段的感受態大腸桿菌細胞在37℃搖床進行1小時的復蘇，然后將菌液離心，并用涂布棒均勻涂在含有卡那霉素抗性的lb培養基上；
17、(5)質粒鑒定及提取：
18、在卡那霉素篩選培養基上挑取陽性克隆菌落，并用聚合酶擴增反應對陽性克隆進行檢測，對檢測成功的陽性克隆進行質粒提取即可得到△sgiv163重組病毒載體質粒；
19、(6)重組病毒篩選：
20、將重組質粒利用轉染試劑lipofectamine?2000脂質體轉染進健康石斑魚脾臟細胞，然后利用g418抗性對細胞進行篩選，利用野生型sgiv對篩選細胞進行感染，感染3天后觀察綠色熒光表達情況，并且收集子代病毒，即得sgiv163缺失的重組新加坡石斑魚虹彩病毒。
21、本專利技術的第六個目的是提供由上述的構建方法獲得的重組新加坡石斑魚虹彩病毒。
22、本專利技術的第七個目的是提供上述的重組新加坡石斑魚虹彩病毒在研究mir-122對新加坡石斑魚虹彩病毒的作用機制中的應用。
23、本專利技術的第八個目的是提供上述的重組新加坡石斑魚虹彩病毒在新加坡石斑魚抗病毒免疫中的應用。
24、本專利技術的優點：
25、在本專利技術中，我們發現sgiv病毒上存在mir-122的靶標序列，并且把該序列命名為sgiv163，通過構建sgiv163基因缺失的重組病毒△163-sgiv，將有助于更加直觀理解mir-122在sgiv病毒發病機制中的作用。
26、本專利技術構建斜帶石斑魚脾臟細胞的△163-sgiv重組病毒，介導病毒基因sgiv163的低表達，為研究mir-122對新加坡石斑魚虹彩病毒的直接作用包括病毒感染、侵襲和復制提供良好的實驗基礎及依據。并且本實驗用到的pdsred2-c1載體、pegfp載體、pcdna-3.1-3ha載體，pmir-rb-report載體、dna聚合酶、dna連接酶、核酸提取試劑盒、及限制性內切酶等試劑購買方便，操作簡單，并且耗時短，重組敲降目的基因的效率高，重組病毒穩定，并且本專利技術是首次探究mirna對新加坡石斑魚虹彩病毒的直接靶標所發揮的作用，能為日后的深入研究提供借鑒。
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1.一種新加坡石斑魚虹彩病毒SGIV163基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。
2.SGIV163基因缺失在降低新加坡石斑魚虹彩病毒復制能力中的應用。
3.SGIV163基因缺失在抑制石斑魚miR-122提升SGIV病毒蛋白MCP表達中的應用。
4.一種誘導SGIV163基因缺失的重組病毒載體質粒，其特征在于，包括SGIV病毒基因片段SGIV162L、綠色熒光蛋白基因EGFP、SGIV病毒ICP18啟動子和SGIV病毒基因片段SGIV1，所述SGIV162L的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述EGFP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述ICP18啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述SGIV1的核苷酸序列如SEQ?IDNO.4所示。
5.根據權利要求4所述的重組病毒載體質粒，其特征在于，為SEQ?ID?NO.1-4所示的核苷酸序列依次相連插入pDsRed2-C1載體。
6.一種miR-122靶標基因SGIV163缺失的重組新加坡石斑魚虹彩病毒的構建方法，其特征在于，
7.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于構建過程簡單快捷，步驟概括如下：
8.由權利要求6-7任一所述的構建方法獲得的重組新加坡石斑魚虹彩病毒。
9.權利要求8所述的重組新加坡石斑魚虹彩病毒在研究miR-122對新加坡石斑魚虹彩病毒的作用機制中的應用。
10.權利要求8所述的重組新加坡石斑魚虹彩病毒在新加坡石斑魚抗病毒免疫中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種新加坡石斑魚虹彩病毒sgiv163基因，其特征在于，核苷酸序列如seq?id?no.5所示。
2.sgiv163基因缺失在降低新加坡石斑魚虹彩病毒復制能力中的應用。
3.sgiv163基因缺失在抑制石斑魚mir-122提升sgiv病毒蛋白mcp表達中的應用。
4.一種誘導sgiv163基因缺失的重組病毒載體質粒，其特征在于，包括sgiv病毒基因片段sgiv162l、綠色熒光蛋白基因egfp、sgiv病毒icp18啟動子和sgiv病毒基因片段sgiv1，所述sgiv162l的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述egfp的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述icp18啟動子的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，所述sgiv1的核苷酸序列如seq?idno.4所示。
5.根據權利要求4所述的重組病毒載體...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫紅巖，何家揚，雷玉容，陳驍，于宗赫，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：
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