【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于但不限于基因工程技術，尤其涉及一種布魯氏菌效應蛋白bspe基因缺失株的構建方法及應用方法。
技術介紹
1、布魯氏菌病(brucellosis)是一種由布魯氏菌引起的人畜共患病，對人類健康及畜牧業的經濟發展構成了極大的威脅。目前，布魯氏菌病的防控主要依靠減毒活疫苗，雖然起到了重要的防控作用，但也存在一些問題，如干擾診斷、殘存毒力及孕畜流產等。
2、許多胞內寄生菌通過分泌效應蛋白來促進它們在宿主細胞中的生存和增殖。布魯氏菌通過分泌多種毒力因子逃避機體的免疫應答，在機體內生存和增殖。t4ss是布魯氏菌重要的毒力因子，其所分泌的效應蛋白對布魯氏菌在細胞中的生存和感染后的免疫反應具有調控作用。目前已發現17個與t4ss相關的效應蛋白，分別為vcea、vcec、rica、bpe005、bpe043、bpe123、bpe275、btpa、btpb、sepa、bspa、bspb、bspc、bspe、bspf、bspj及bspl，它們在布魯氏菌感染宿主的過程中發揮著重要作用。
3、在現有的布魯氏菌病防控技術中，主要存在以下三個問題：
4、1.疫苗問題：減毒活疫苗雖然在防控布魯氏菌病中發揮了一定作用，但其存在的殘存毒力和干擾診斷問題，導致在接種疫苗的動物中難以區分感染個體。此外，疫苗使用在孕畜中引發流產，給畜牧業帶來經濟損失。
5、2.效應蛋白功能不明確：雖然布魯氏菌的t4ss系統及其分泌的17種效應蛋白在感染和免疫逃逸中起重要作用，但bspe蛋白的功能仍不清楚，限制了對其在宿主感染過程
6、3.逃逸機制復雜：布魯氏菌通過分泌多種毒力因子逃避宿主的免疫應答，現有的研究對于布魯氏菌在宿主細胞內生存機制的解析還不夠全面，導致防治方法無法有效針對其免疫逃逸特性進行精確控制。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的問題，本專利技術涉及一種無痕基因敲除技術，以牛種布魯氏菌a19株為研究對象，構建布魯氏菌效應蛋白bspe基因缺失株的方法及應用。
2、本專利技術是這樣實現的，一種牛種布魯氏菌效應蛋白bspe基因缺失株的構建方法，利用同源重組及sacb反向篩選技術構建bspe基因缺失株，包括以下步驟：
3、步驟一，根據牛種布魯氏菌基因組序列，設計bspe上、下游同源臂引物以及鑒定引物；
4、步驟二，以滅活的牛種布魯氏菌a19菌株為模板，用高保真酶對bspe基因的上、下游同源臂進行擴增，pcr產物經電泳驗證成功后進行膠回收處理；
5、步驟三，以步驟二的反應產物為模板，以bspe-up-f和bspe-down-r為引物進行擴增，pcr產物經電泳驗證成功后進行膠回收處理，獲得bspe上、下游同源臂基因融合dna片段；
6、步驟四，puc19-δbspe重組質粒的構建；使用clonexpress一步法，將步驟三回收的融合dna片段與puc19-sacb質粒進行反應；
7、步驟五，a19δbspe缺失菌株的構建及篩選；制備牛種布魯氏菌a19感受態細胞，利用引物bspe-pc-f和bspe-pc-r進行pcr鑒定，篩選bspe基因缺失株。
8、進一步，所述步驟一中的引物包括：
9、bspe-up-f：acctgcaggcatgcaagcttaaaatagctgcggaacgc；
10、bspe-up-r：atcgaacaggagaccagacgccgcaccatgctgaagc；
11、bspe-down-f：gcttcagcatggtgcggcgtctggtctcctgttcgat；
12、bspe-down-r：accatgattacgccaagcttttttcgaccgcaatgcag；
13、bspe-pc-f：aaacaagggcgtatcagcg；
14、bspe-pc-r：aaaccccggactttgaaacc。
15、進一步，所述步驟二中擴增條件為：98℃預變性10min；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃延伸10min；bspe基因上游同源臂擴增體系為25μl：primer?starmax?premix：12.5μl；牛種布魯氏菌a19菌液：3μl；bspe-up-f：1μl；bspe-up-r：1μl；ddh2o：7.5μl；bspe基因下游同源臂擴增體系為25μl：primer?starmax?premix：12.5μl；牛種布魯氏菌a19菌液：3μl；bspe-down-f：1μl；bspe-down-r：1μl；ddh2o：7.5μl。
16、進一步，所述步驟三中擴增條件為：98℃預變性10min；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃延伸10min；bspe基因上游同源臂擴增體系為25μl：primer?starmax?premix：12.5μl；模板：3μl；bspe-up-f：1μl；bspe-down-r：1μl；ddh2o：7.5μl。
17、進一步，步驟四的具體操作過程如下：
18、連接體系20μl：步驟三反應產物：8μl，puc19-sacb：2μl，2×clonexpress?mix：10μl，在50℃水浴鍋中孵育45min后轉化到大腸桿菌感受態細胞dh5α中，涂布于含卡那霉素50μg/ml的lb平板上，挑取單克隆至含卡那霉素50μg/ml的lb液體培養基中，37℃震蕩培養12h，取菌液進行菌液pcr檢測，陽性菌液送公司進行測序。
19、進一步，步驟五的具體操作過程如下：
20、在無抗tsa平板上挑取生長良好的牛種布魯氏菌a19單菌落，接種于15ml?tsb液體培養基中，37℃、180r/min恒溫搖床培養至對數生長期(od600≈0.6)制備布魯氏菌感受態細胞；
21、牛種布魯氏菌感受態細胞的制備方法：將凍存于-80℃的牛種布魯氏菌a19疫苗株劃線復蘇于無抗的tsa固體培養基上，37℃培養72h；挑取單克隆菌落接種于15ml?tsb液體培養基中，37℃、180r/min培養至對數生長期(od600≈0.6)；取培養至對數生長期的菌液，冰浴1h，4℃、5000r/min離心5min，收集菌體；用4℃預冷的10ml?ddh2o重懸菌體，4℃、5000r/min離心5min，棄上清，重復三次；用4℃預冷的10ml?10％無菌甘油重懸菌體，4℃、5000r/min離心5min，棄上清，重復三次；最后吸凈上清，用200μl?10％無菌甘油重懸沉淀，分裝兩管，置于冰盒上。
22、進一步，a19δbspe缺失菌株的構建及篩選方法：將測序正確的重組質粒puc19-δbspe與a19感受態細胞混合均勻，冰浴1h，轉至電擊杯中，施加2.5kv電壓，按閃電電擊后立即加tsb培養液，轉至15ml離心管本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種牛種布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的牛種布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株的構建方法，其特征在于，所述步驟一中的引物包括：
3.如權利要求1所述的牛種布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株的構建方法，其特征在于，所述步驟二中擴增條件為：98℃預變性10min；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃延伸10min；BspE基因上游同源臂擴增體系為25μL：Primer?StarMaxPremix：12.5μL；牛種布魯氏菌A19菌液：3μL；BspE-up-F：1μL；BspE-up-R：1μL；ddH2O：7.5μL；BspE基因下游同源臂擴增體系為25μL：Primer?StarMax?Premix：12.5μL；牛種布魯氏菌A19菌液：3μL；BspE-down-F：1μL；BspE-down-R：1μL；ddH2O：7.5μL。
4.如權利要求1所述的牛種布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株的構建方法，其特征在于，所述步驟三中擴增條件為
5.如權利要求1所述的牛種布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株的構建方法，其特征在于，步驟四的具體操作過程如下：
6.如權利要求1所述的牛種布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株的構建方法，其特征在于，步驟五的具體操作過程如下：
7.如權利要求6所述的牛種布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株的構建方法，其特征在于，A19ΔBspE缺失菌株的構建及篩選方法：將測序正確的重組質粒pUC19-ΔBspE與A19感受態細胞混合均勻，冰浴1h，轉至電擊杯中，施加2.5KV電壓，按閃電電擊后立即加TSB培養液，轉至15mL離心管，37℃、180r/min搖床培養48h，復蘇后涂布于含25μg/mL卡那霉素的TSA板上，37℃培養3天；挑取單菌落至含50μg/mL卡那霉素的TSB液體培養基中，培養到對數生長期后將其涂布于含10％蔗糖的TSA板上，37℃培養3天；挑單克隆菌落于TSB培養液中，培養至對數生長后取200μL菌液，在90℃水浴鍋中滅活1h，利用引物BspE-PC-F和BspE-PC-R進行菌液PCR鑒定，篩選BspE基因缺失株。
8.一種如權利要求1-7任意一項所述的牛種布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株的構建方法所構建的BspE基因缺失株在制備預防布魯氏菌感染的疫苗中的應用方法，其特征在于，該應用方法包括：
9.如權利要求1所述的牛種布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株在疫苗開發中的應用方法，其特征在于，所述BspE基因缺失株作為減毒疫苗株，用于牛種布魯氏菌感染的預防，具體通過實驗評估該疫苗株在免疫接種后的保護效果和安全性。
10.如權利要求1所述的牛種布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株在藥物篩選中的應用方法，其特征在于，利用BspE基因缺失株構建布魯氏菌體外感染模型，篩選針對布魯氏菌感染的抗菌藥物，具體通過測定藥物對該缺失株生長抑制的效果來進行藥物篩選。
...【技術特征摘要】
1.一種牛種布魯氏菌效應蛋白bspe基因缺失株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的牛種布魯氏菌效應蛋白bspe基因缺失株的構建方法，其特征在于，所述步驟一中的引物包括：
3.如權利要求1所述的牛種布魯氏菌效應蛋白bspe基因缺失株的構建方法，其特征在于，所述步驟二中擴增條件為：98℃預變性10min；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃延伸10min；bspe基因上游同源臂擴增體系為25μl：primer?starmaxpremix：12.5μl；牛種布魯氏菌a19菌液：3μl；bspe-up-f：1μl；bspe-up-r：1μl；ddh2o：7.5μl；bspe基因下游同源臂擴增體系為25μl：primer?starmax?premix：12.5μl；牛種布魯氏菌a19菌液：3μl；bspe-down-f：1μl；bspe-down-r：1μl；ddh2o：7.5μl。
4.如權利要求1所述的牛種布魯氏菌效應蛋白bspe基因缺失株的構建方法，其特征在于，所述步驟三中擴增條件為：98℃預變性10min；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃延伸10min；bspe基因上游同源臂擴增體系為25μl：primer?starmaxpremix：12.5μl；模板：3μl；bspe-up-f：1μl；bspe-down-r：1μl；ddh2o：7.5μl。
5.如權利要求1所述的牛種布魯氏菌效應蛋白bspe基因缺失株的構建方法，其特征在于，步驟四的具體操作過程如下：
6.如權利要求1所述的牛種布魯...
【專利技術屬性】
技術研發人員：許健，儲岳峰，張思嵐，劉立元，鄭福英，支飛杰，羅意，
申請(專利權)人：中國農業科學院蘭州獸醫研究所中國動物衛生與流行病學中心蘭州分中心，
類型：發明
國別省市：
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