一株噬菌體在削減霍亂傳播中的應用，該噬菌體φYSZKA，于2018年08月01日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO:M?2018513，分類命名為肺炎克雷伯氏菌噬菌體φYSZKA（Klebsiella?phage?φYSZKA）。這一方法解決了傳統裂解噬菌體二次污染、霍亂弧菌傳播廣等問題。噬菌體施用可以降低海洋、土壤和下水道中霍亂弧菌產毒效率，從而為霍亂疫情的防控和霍亂癥狀的減輕提供更多可能性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于噬菌體，具體涉及一株噬菌體在削減霍亂傳播中的應用。
技術介紹
1、目前主要通過口服補液治療霍亂患者，未從根本上處置霍亂疫情環境中大量存在的霍亂弧菌。已知霍亂弧菌編碼霍亂毒素基因對霍亂弧菌致病性產生重要影響。具體而言，霍亂弧菌微觀編碼霍亂毒素基因
ctxa和
ctxb，造成腸粘膜細胞失水，并最終在宏觀尺度上導致腹瀉、嘔吐和脫水死亡。因而，在微觀層面上根本的減少霍亂弧菌毒素合成，進一步研發阻控霍亂疫情傳播風險的技術專利技術十分必要和迫切。
2、微生物類群互作能夠調控細菌的基因表達，細菌噬菌體（簡稱噬菌體）與宿主細菌是實現跨界互作的典型。噬菌體是專性侵染活體宿主細菌而存活的生物體，在水體、土壤和空氣中均廣泛分布，據估算其總量達到1031數量級。同時噬菌體具備裂解和溶源兩種生活方式。溶源噬菌體將遺傳物質整合進宿主細菌的基因組中，使得噬菌體基因組得以保持"前噬菌體"（prophage）狀態穩定存在于宿主細菌基因組中，并跟隨宿主細菌復制。溶源噬菌體攜帶輔助代謝基因(auxiliary?metabolic?genes，amgs)，成功整合后借此補充宿主細菌代謝。因此，溶源性噬菌體可以作為穩定的遺傳載體補償宿主多種生理功能的表達。此外，前噬菌體通過增殖釋放噬菌體顆粒，感染環境中其他宿主細菌，進而促進水平基因轉移。因此，溶源噬菌體通過攜帶毒素抑制輔助代謝基因，協助宿主細菌減弱霍亂毒素基因的合成表達功能，最終實現抑制霍亂疫情傳播的目的。
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p>3、噬菌體合成是指利用合成生物學的方法，定向設計攜帶功能基因的人工噬菌體。通過合成人工噬菌體：能夠定量辨析噬菌體在環境微生物組中的角色和作用，便于人工干預設計攜帶毒素抑制amgs的溶源性噬菌體，利用溶源噬菌體的輔助代謝能力和不產生裂解dna造成二次污染的特性，進一步提高原有噬菌體在減弱霍亂弧菌致病性和抑制霍亂疫情傳播的防控效果。4、通過相關文獻查閱和專利檢索，并未發現有關以噬菌體amgs調控霍亂弧菌毒素產生能力，抑制霍亂疫情傳播生物技術的公開發表和受理，與本專利技術最接近的現有方法是：利用裂解噬菌體來裂解有害弧菌細胞，進而控制水體中多種弧菌的生長，如專利技術公開號cn114561363a、cn115786277a、cn115717128a?和cn117778333b是通過篩選分離廣譜裂解性噬菌體裂解水體或水產養殖環境中多個弧菌種，解決水產養殖中出現的多種細菌病害感染問題。而專利技術公開號cn118028249a則通過制備一種含有耐高溫型霍亂弧菌噬菌體rdp-vc23062的水產飼料添加劑，用于替代抗生素防控水產養殖動物細菌性疾病，同時該專利技術還涵蓋了添加劑的制備方法和應用策略。除將裂解性噬菌體用于水體弧菌防治外，也有專利技術通過篩選霍亂弧菌拮抗菌株枯草芽孢桿菌(
bacillus?subtills)?yjy20-01，使其競爭性排斥霍亂弧菌、提供營養物質，促進養殖動物的生長，從而降低了水產動物感染霍亂弧菌風險。這幾種方法指出裂解性噬菌體或拮抗菌株具備抑制養殖環境中弧菌生長的能力，但是普遍缺乏對弧菌裂解后毒素基因dna產物二次污染的風險管控，且缺乏在更廣泛的除水產養殖環境外環境中的應用潛力。
5、現有技術存在的主要缺陷是：?現有關于霍亂弧菌的噬菌體防治技術多數針對于水產養殖環境中霍亂弧菌及其他弧菌種，忽視了多種環境中o1致病型霍亂弧菌的致病性調控。此外，經由人工篩選的裂解性噬菌體裂解霍亂弧菌后，其裂解毒素基因dna產物可以被水體中其他微生物吸收，存在二次污染風險。而口服補液治療霍亂患者普遍存在無法解決環境霍亂弧菌傳播的問題。
6、缺陷產生的主要原因有：由于噬菌體可以作為抗生素替代品殺滅環境中病原菌，導致裂解性噬菌體的應用案例遠多于噬菌體amgs。然而，裂解性噬菌體裂解病原菌后的裂解產物存在被環境微生物吸收的風險，且難以評估長期負面的生態影響。因此，添加具備毒素抑制功能的溶源性噬菌體，降低致病性霍亂弧菌比例，同時削減霍亂疫情風險的噬菌體防控技術具有重要意義。
技術實現思路
1、解決的技術問題：專利技術針對上述現有技術缺陷，提供一株噬菌體在削減霍亂傳播中的應用。該方法將噬菌體施放到多種霍亂疫情爆發環境中，采用噬菌體注入毒素抑制amgs減弱宿主霍亂弧菌毒力的方式削減霍亂傳播風險，同時避免了裂解噬菌體裂解弧菌后造成的二次毒素基因dna污染風險。
2、技術方案：噬菌體φyszka在制備抑制霍亂弧菌毒素基因產品中的應用，所述噬菌體φyszka，于2018年08月01日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：cctcc?no:m2018513，分類命名為肺炎克雷伯氏菌噬菌體φyszka（
klebsiella?phage?φyszka）。
3、上述噬菌體φyszka在制備減少環境中弧菌裂解后釋放的毒素基因dna產品中的應用。
4、上述噬菌體φyszka在制備通過減少環境中弧菌裂解后釋放的毒素基因dna來削減霍亂傳播產品中的應用。
5、上述霍亂弧菌毒素基因為
ctxa和
ctxb。
6、上述產品中還包含其他抑制霍亂弧菌產毒的生物或化學物質。
7、上述產品中還包含至少一種載體或輔助成分，用于提高噬菌體的穩定性、儲存壽命或應用效果。
8、一種降低霍亂疫情傳播速率的方法，向海洋、土壤或城市水體中注入所述產品。
9、上述降低霍亂疫情傳播速率的方法，還包括監測環境中霍亂弧菌毒素含量的變化，并根據需要調整產品的施用量。
10、本專利技術的工作原理是：?1.?噬菌體是地球上物種豐富度最高的一類生命體，專屬侵染活體宿主細菌；2.?噬菌體是一類由蛋白質衣殼（60%）和核酸（40%）組成的細菌病毒，在環境中存在穩定，長度約在20~200μm相當于細菌的幾百及上千分之一，能夠實現在環境中的遷移，有利于節約施用成本；3.?噬菌體編碼的輔助代謝基因（auxiliary?metabolicgenes,?amgs）可以通過水平基因轉移，傳遞給宿主細菌，抑制宿主關鍵功能的表達，如：霍亂毒素產生過程；4.?霍亂弧菌的致病性取決于霍亂毒素的產生，本專利技術提供的噬菌體整合到宿主基因組后抑制霍亂毒素的產生。
11、有益效果：1.?削弱霍亂弧菌致病性。噬菌體通過amgs抑制毒素基因表達，減少環境中霍亂毒素含量，穩定控制環境中致病性霍亂弧菌數量增長；2.?減少口服補液使用。噬菌體移植通過減小霍亂弧菌致病性，抑制霍亂癥狀表現，降低霍亂患者醫療救治中口服補液用量；總之，噬菌體移植削減環境霍亂弧菌致病性結合現代生物合成學和生態學原理，提供了一種高效、環保的霍亂疫情防控方式，對于實現削減霍亂傳播具有重要意義。
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【技術保護點】
1.噬菌體φYSZKA在制備抑制霍亂弧菌毒素基因產品中的應用，所述噬菌體φYSZKA，于2018年08月01日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO:M?2018513，分類命名為肺炎克雷伯氏菌噬菌體φYSZKA（Klebsiella?phage?φYSZKA）。
2.權利要求1所述噬菌體φYSZKA在制備減少環境中弧菌裂解后釋放的毒素基因DNA產品中的應用。
3.權利要求1所述噬菌體φYSZKA在制備通過減少環境中弧菌裂解后釋放的毒素基因DNA來削減霍亂傳播產品中的應用。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述霍亂弧菌毒素基因為ctxA和ctxB。
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述產品中還包含其他抑制霍亂弧菌產毒的生物或化學物質。
6.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述產品中還包含至少一種載體或輔助成分，用于提高噬菌體的穩定性、儲存壽命或應用效果。
7.一種降低霍亂疫情傳播速率的方法，其特征在于，向海洋、土壤或城市水體中注入權利要求2所述的產品。
8.根據權利要求7所述降低霍亂疫情傳播速率的方法，其特征在于，還包括監測環境中霍亂弧菌毒素含量的變化，并根據需要調整產品的施用量。
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【技術特征摘要】
1.噬菌體φyszka在制備抑制霍亂弧菌毒素基因產品中的應用，所述噬菌體φyszka，于2018年08月01日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：cctcc?no:m?2018513，分類命名為肺炎克雷伯氏菌噬菌體φyszka（klebsiella?phage?φyszka）。
2.權利要求1所述噬菌體φyszka在制備減少環境中弧菌裂解后釋放的毒素基因dna產品中的應用。
3.權利要求1所述噬菌體φyszka在制備通過減少環境中弧菌裂解后釋放的毒素基因dna來削減霍亂傳播產品中的應用。
4.根據權利要求1所述的應用...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫明明，苑書建，張文，高卓凡，王毅，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：
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