【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及細胞分離培養，具體為從骨髓分離細胞并誘導生成內皮祖細胞的方法。
技術介紹
1、內皮祖細胞是血管內皮細胞的前體細胞，亦稱為成血管細胞(angioblast)，是一群具有分化為成熟內皮細胞并參與新血管形成的潛能的細胞。有研究表明心血管功能和血管發生受到起源于骨髓的內皮祖細胞的顯著調節，增加血管發生，提高血管修復和改善內皮功能。因此，在心肌梗死、動脈粥樣硬化、糖尿病周圍血管病變等缺血性疾病中，內皮祖細胞有廣泛的應用前景。
2、骨髓是機體的造血組織，位于身體的許多骨骼內。成年動物的骨髓分兩種：紅骨髓和黃骨髓。紅骨髓能制造紅細胞、血小板和各種白細胞。血小板有止血作用，白細胞能殺滅與抑制各種病原體，包括細菌、病毒等；某些淋巴細胞能制造抗體。因此，骨髓不但是造血器官，它還是重要的免疫器官。骨髓是存在于長骨(如肱骨、股骨)的骨髓腔和扁平骨(如髂骨)的稀松骨質間的網眼中，是一種海綿狀的組織，能產生血細胞的骨髓略呈紅色，稱為紅骨髓。出生時，紅骨髓充滿全身骨髓腔，隨著年齡增大，脂肪細胞增多，相當部分紅骨髓被黃骨髓取代，最后幾乎只有扁平骨骨髓腔中有紅骨髓。
3、研究發現，內皮祖細胞主要存在于骨髓、臍血和外周血，但是少量的內皮祖細胞也被發現存在于脂肪組織、脾臟、心臟、血管、骨骼肌部位。外周血中所含內皮祖細胞極低，臍血獲得途徑較為困難，因此選用骨髓來分離內皮祖細胞。用于分離骨髓細胞的方法主要有五種，其中密度梯度離心法、貼壁篩選法、免疫磁珠法較為常用。采用免疫磁珠法雖然獲得的細胞純度較高，但是操作復雜，費用昂貴，因此目前
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種從骨髓分離細胞并誘導生成內皮祖細胞的方法，以解決上述
技術介紹
提出的的問題。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：從骨髓分離細胞并誘導生成內皮祖細胞的方法，包括下列步驟：
3、步驟一：用頸椎脫臼法處死sd大鼠，用75％乙醇浸泡；
4、步驟二：隨后在鼠的腿部位置剪開，取出大鼠下肢股骨和脛骨；
5、步驟三：用眼科剪剪去股骨和脛骨兩端，暴露骨髓腔；
6、步驟四：配制內皮祖細胞完全培養基，使用含5％胎牛血清、1％ecgs、1％ps的ecm培養基；
7、步驟五：用注射器以完全培養基反復沖洗骨髓腔直至骨頭發白；
8、步驟六：收集骨髓液，離心去除上清液；
9、步驟七：加入適量培養基接種于六孔板中，置于37℃、5％co2恒溫培養箱中培養；
10、步驟八：72h后換液去除未貼壁細胞，隨后每2天換液一次，直至需要傳代；
11、步驟九：細胞傳代培養，待細胞融合度達到80％左右后，使用0.25％的質量百分比濃度的胰蛋白酶消化收集細胞，接種至t25培養瓶中進行培養。
12、作為本專利技術優選的技術方案，在步驟二中，取出的雙側股骨和脛骨浸泡于無菌含雙抗的1×pbs中，并用含雙抗的1×pbs清洗3次。
13、作為本專利技術優選的技術方案，在步驟六中，收集的骨髓液用200目細胞篩過濾去除大量雜質。
14、作為本專利技術優選的技術方案，在步驟八中，72h后換液去除未貼壁細胞是由于在骨髓中的細胞分化能力強，能誘導生成內皮祖細胞的是分離骨髓后培養72h后內貼壁的細胞。
15、與現有技術相比，本專利技術的有益效果是：本專利技術采用的直接貼壁篩選誘導法獲得的內皮祖細胞方法和培養簡單，成本低，細胞活性好，純度高，最終收獲細胞濃度高，能快速高效分離誘導內皮祖細胞，培養48h左右即可看到細胞貼壁生長并有明顯細胞形態，且增殖迅速，對原代細胞的獲得率有明顯提高，最終收獲細胞濃度高，整個內皮祖細胞培養工藝能夠標準化、程序化、規范化。
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1.從骨髓分離細胞并誘導生成內皮祖細胞的方法，其特征在于，包括下列步驟：
2.如權利要求1中骨髓分離細胞并誘導生成內皮祖細胞的方法，其特征在于：在步驟二中，取出的雙側股骨和脛骨浸泡于無菌含雙抗的1×PBS中，并用含雙抗的1×PBS清洗3次。
3.如權利要求1中骨髓分離細胞并誘導生成內皮祖細胞的方法，其特征在于：在步驟六中，收集的骨髓液用200目細胞篩過濾去除大量雜質。
4.如權利要求1中骨髓分離細胞并誘導生成內皮祖細胞的方法，其特征在于：在步驟八中，72h后換液去除未貼壁細胞是由于在骨髓中的細胞分化能力強，能誘導生成內皮祖細胞的是分離骨髓后培養72h后內貼壁的細胞。
【技術特征摘要】
1.從骨髓分離細胞并誘導生成內皮祖細胞的方法，其特征在于，包括下列步驟：
2.如權利要求1中骨髓分離細胞并誘導生成內皮祖細胞的方法，其特征在于：在步驟二中，取出的雙側股骨和脛骨浸泡于無菌含雙抗的1×pbs中，并用含雙抗的1×pbs清洗3次。
3.如權利要求1中骨髓分離細胞并誘導生...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃水傳，江簫揚，白彤彤，
申請(專利權)人：南方醫科大學南方醫院，
類型：發明
國別省市：
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