【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法。
技術(shù)介紹
1、特異性免疫球蛋白中和抗體(neutralizing?antibodies,nab)是一類能夠特異性識(shí)別并結(jié)合病原體(如病毒、細(xì)菌等)表面的特定抗原表位，從而阻止病原體與其宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合或進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗體。中和抗體在免疫防御中起著至關(guān)重要的作用，能夠有效防止病原體的感染和傳播。其作用機(jī)制主要是通過(guò)結(jié)合病原體表面的關(guān)鍵位點(diǎn)，阻止病原體與其宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合；阻止病原體進(jìn)入宿主細(xì)胞，從而防止其在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和擴(kuò)散；而且中和抗體與病原體結(jié)合后，可以標(biāo)記病原體，促進(jìn)其被免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)吞噬和清除。
2、在實(shí)際運(yùn)用階段，測(cè)定中和抗體效價(jià)可以幫助了解自然感染后個(gè)體的免疫狀態(tài)，評(píng)估其對(duì)再次感染的抵抗力；且有助于研究病原體的免疫機(jī)制，了解抗體與病原體的相互作用；在新藥開(kāi)發(fā)過(guò)程中，測(cè)定中和抗體效價(jià)可以幫助評(píng)估候選藥物的免疫效果，指導(dǎo)藥物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化。目前，中和抗體效價(jià)的測(cè)定方法通常有微中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)以及流式細(xì)胞術(shù)。但是在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，針對(duì)本公司研發(fā)的人免疫球蛋白(ph4)、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、人免疫球蛋白中間產(chǎn)品(原液、半成品)及成品中的巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)與其基質(zhì)所引起的干擾、線性范圍及樣品本身對(duì)該試驗(yàn)方法所使用的細(xì)胞(mrc-5、vero、rd)是否會(huì)導(dǎo)致cpe未知、盲傳巨細(xì)胞病毒滴度未知，使得測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性受到一定的額影響，且供試品在96孔板上的檢測(cè)結(jié)果往往有“邊緣效應(yīng)”，容
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)意在提供一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性免疫球蛋白中和抗體效價(jià)的準(zhǔn)確檢測(cè)。
2、為達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，采用karber法進(jìn)行檢測(cè)，在檢測(cè)前將供試品稀釋至無(wú)細(xì)胞毒性；
3、供試品效價(jià)(u/ml)＝b標(biāo)×n標(biāo)準(zhǔn)品/n供試品；式中：
4、b標(biāo)＝國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)；
5、n供試品＝供試品中和抗體滴度；
6、n標(biāo)準(zhǔn)品＝國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品中和抗體滴度。
7、優(yōu)選的，作為一種改進(jìn)，標(biāo)準(zhǔn)品和供試品中和滴度計(jì)算公式為：n＝2l+d(s-0.5)；式中：
8、l＝最高稀釋度的對(duì)數(shù)；
9、d＝稀釋度對(duì)數(shù)之間的差；
10、s＝未出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)的孔比率綜合。
11、優(yōu)選的，作為一種改進(jìn)，供試品為靜注人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白或人免疫球蛋白。
12、優(yōu)選的，作為一種改進(jìn)，靜注人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、人免疫球蛋白稀釋至無(wú)細(xì)胞毒性的最小稀釋倍數(shù)分別為mrc-5細(xì)胞：16倍、16倍、8倍和32倍；vero細(xì)胞：16倍、16倍、32倍和32倍；rd細(xì)胞：8倍、16倍、8倍和16倍。
13、優(yōu)選的，作為一種改進(jìn)，在滴加樣品時(shí)，在96孔板的外圈加入pbs或純化水。
14、優(yōu)選的，作為一種改進(jìn)，供試品的每個(gè)濃度梯度平行8個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。
15、優(yōu)選的，作為一種改進(jìn)，一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，包括如下步驟：
16、步驟一、細(xì)胞維持液的制備：將滅能后的胎牛血清加入dmem培養(yǎng)基，即得細(xì)胞維持液；
17、步驟二、中和用病毒液的制備：將巨細(xì)胞病毒根據(jù)病毒滴度用稀釋液稀釋到100ccid50，即得中和用病毒液；
18、步驟三、供試品稀釋：將靜注人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、人免疫球蛋白稀釋至無(wú)細(xì)胞毒性，再進(jìn)行二倍系列稀釋，稀釋6個(gè)梯度；
19、步驟四、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至線性范圍內(nèi)，再在96孔板內(nèi)進(jìn)行二倍系列稀釋；
20、步驟五、病毒回滴：取中和用病毒液做10倍系列梯度稀釋，加入細(xì)胞維持液，而后轉(zhuǎn)移至已預(yù)先加入細(xì)胞維持液的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度平行做8孔，共6個(gè)梯度；
21、步驟六、病毒中和：將系列梯度稀釋后的供試品各孔中分別加入中和用病毒液，混勻后將各細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃、5％二氧化碳條件下中和；
22、步驟七、試驗(yàn)用細(xì)胞的制備：選用生長(zhǎng)良好的單層細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至試驗(yàn)用細(xì)胞懸液濃度；
23、步驟八、感染：中和結(jié)束后，向各板每孔加入50μl濃度為1.5×105cells/ml的細(xì)胞懸液，并培養(yǎng)；
24、步驟九、結(jié)果判定。
25、本技術(shù)方案中，在步驟七中，巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)測(cè)定使用mrc-5細(xì)胞、合胞病毒中和抗體效價(jià)測(cè)定使用vero細(xì)胞、ev71病毒中和抗體效價(jià)測(cè)定使用rd細(xì)胞。
26、優(yōu)選的，作為一種改進(jìn)，步驟六中，中和時(shí)間為1.5h。
27、優(yōu)選的，作為一種改進(jìn)，步驟七中，細(xì)胞懸液的濃度為1.5×105cells/ml。
28、優(yōu)選的，作為一種改進(jìn)，步驟八中，培養(yǎng)條件為37℃、5％二氧化碳。
29、本方案的原理及優(yōu)點(diǎn)是：實(shí)際應(yīng)用時(shí)，本技術(shù)方案中，基針對(duì)我司生產(chǎn)的免疫球蛋白類產(chǎn)品-靜注人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、人免疫球蛋白，進(jìn)行了供試品毒性分析，在進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)前進(jìn)行稀釋，使其無(wú)細(xì)胞毒性，避免因細(xì)胞毒性而影響測(cè)試結(jié)果。此外，在對(duì)效價(jià)檢測(cè)的過(guò)程中(基于kabar法)，“邊緣效應(yīng)”通常是難以解決的問(wèn)題，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，從而影響結(jié)果判定。基于此，專利技術(shù)人在96孔板外圈加入pbs(也可使用純化水)，以此規(guī)避。而在結(jié)果表征階段，傳統(tǒng)的方法通常使用滴度代表計(jì)算結(jié)果，但通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)滴度計(jì)算結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確度變化較大?；诖耍炯夹g(shù)方案每次實(shí)驗(yàn)均加入標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)對(duì)比的方式計(jì)算出供試品的結(jié)果(u/ml，或iu/ml)，這種通過(guò)加入標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比所得結(jié)果變異系數(shù)顯著優(yōu)于直接使用滴度。
30、在技術(shù)研發(fā)階段，中和抗體效價(jià)測(cè)定過(guò)程中，病毒毒力的控制是本技術(shù)方案的研發(fā)難點(diǎn)及關(guān)鍵點(diǎn)之一，因病毒不穩(wěn)定，測(cè)試結(jié)果存在一定的偏移，在開(kāi)展中和抗體效價(jià)試驗(yàn)前，通過(guò)重復(fù)6次測(cè)定病毒滴度，以平均值作為病毒滴度值進(jìn)行稀釋，以減少試驗(yàn)誤差。另外，供試品的細(xì)胞毒性也是影響試驗(yàn)結(jié)果觀察的關(guān)鍵因素，通過(guò)不斷摸索確定了測(cè)試前供試品稀釋的方案，確定了最小稀釋倍數(shù)將其稀釋至無(wú)細(xì)胞毒性，以規(guī)避供試品細(xì)胞毒性對(duì)測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。此外，在基于kabar法測(cè)試抗體效價(jià)時(shí)，供試品通常以10倍梯度稀釋，而本技術(shù)方案使用2倍梯度稀釋的方式，能夠提高試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度。
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1.一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：采用Karber法進(jìn)行檢測(cè)，在檢測(cè)前將供試品稀釋至無(wú)細(xì)胞毒性；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：標(biāo)準(zhǔn)品和供試品中和滴度計(jì)算公式為：N＝2L+D(S-0.5)；式中：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：所述供試品為靜注人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白或人免疫球蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：靜注人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、人免疫球蛋白稀釋至無(wú)細(xì)胞毒性的最小稀釋倍數(shù)分別為MRC-5細(xì)胞：16倍、16倍、8倍和32倍；Vero細(xì)胞：16倍、16倍、32倍和32倍；RD細(xì)胞：8倍、16倍、8倍和16倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：在滴加樣品時(shí)，在96孔板的外圈加入PBS或純化水。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種特異性免疫球蛋白
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于，包括如下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：步驟六中，中和時(shí)間為1.5h。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：步驟七中，細(xì)胞懸液的濃度為1.5×105cells/ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：步驟八中，培養(yǎng)條件為37℃、5％二氧化碳。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：采用karber法進(jìn)行檢測(cè)，在檢測(cè)前將供試品稀釋至無(wú)細(xì)胞毒性；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：標(biāo)準(zhǔn)品和供試品中和滴度計(jì)算公式為：n＝2l+d(s-0.5)；式中：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：所述供試品為靜注人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白或人免疫球蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種特異性免疫球蛋白中和抗體的效價(jià)測(cè)定方法，其特征在于：靜注人免疫球蛋白、破傷風(fēng)人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、人免疫球蛋白稀釋至無(wú)細(xì)胞毒性的最小稀釋倍數(shù)分別為mrc-5細(xì)胞：16倍、16倍、8倍和32倍；vero細(xì)胞：16倍、16倍、32倍和32倍；rd細(xì)胞：8倍、16倍、8倍和16倍。
...【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：龔志明，羅紅梅，顏芬，周洪槿，郭心怡，楊柳，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：華蘭生物工程重慶有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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