【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥，更具體地說，它涉及人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用及驗證方法。
技術介紹
1、支氣管肺發育不良(bpd)是早產兒中最常見且嚴重的慢性肺病，尤其是在胎齡小于28周的極早產兒中。隨著醫療技術的進步，新型bpd的病理特征發生了變化，從早期與機械通氣和氧療相關的肺損傷，轉變為以肺泡結構簡化、肺泡數量減少、毛細血管發育異常和肺實質發育受損為主要特征的疾病。因此，現有的傳統治療手段在新型bpd中的效果有限，新的治療方法亟需關注如何促進肺發育和修復。
2、在人類肺中，肺泡ii型上皮細胞(at2細胞)是具有自我更新和分化潛力的關鍵肺泡細胞亞型，在bpd的發生和修復過程中起重要作用。at2細胞不僅能分泌肺表面活性物質，維持肺泡張力，還能在肺泡損傷后分化為肺泡i型細胞，參與肺組織的再生。因此，促進at2細胞的功能恢復和分化，對于改善bpd患兒的肺發育至關重要。
3、在過去的十年中，干細胞療法，尤其是人臍帶間充質干細胞(huc-mscs)，在促進組織修復和發育方面展現出了顯著的治療潛力。huc-mscs來源的外泌體(huc-mscs-exos)作為干細胞旁分泌效應的介質，因其含有多種生長因子、細胞因子、微小rna和蛋白質，能夠在組織修復過程中發揮重要作用。外泌體是由雙層脂質膜包裹的小囊泡，攜帶供體細胞的特定活性成分，可以通過調節細胞間的信號傳導，影響靶細胞的功能。但是尚無報道人臍帶間充質干細胞外泌體具有促進肺發育的功效，尤其是針對早產引起的支氣管肺發育不良的報道。
1、本專利技術的目的是提供人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用及驗證方法，以解決現有技術中針對早產引起的支氣管肺發育不良缺乏有效治療手段以及人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育的機制尚未得到充分研究等問題。
2、本專利技術的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，所述人臍帶間充質干細胞外泌體的制備過程包括以下步驟：
3、臍帶清潔和組織切塊：用dulbecco's磷酸鹽緩沖液清潔臍帶，縱向切開，去除動脈和靜脈，將軟凝膠組織切成1-3mm3的小塊；
4、人臍帶間充質干細胞hucmscs培養：將組織塊置于6孔板中，用含有10％胎牛血清和青霉素/鏈霉素的改良鷹氏培養基-α在37℃、5％co2的條件下孵育10-12天，去除臍帶組織后維持培養；
5、無血清培養基處理：將培養的hucmscs在無血清培養基中維持48小時；
6、差速離心：依次順序差速離心去除細胞、細胞碎片和凋亡殘留物；
7、超速離心：以120000×g的速度進行1.5小時和2小時的超速離心，收集外泌體沉淀；
8、外泌體沉淀收集與懸浮：將所述外泌體沉淀重新懸浮于200μl的dulbecco's磷酸鹽緩沖液中，供后續研究使用。
9、其中，所述維持培養的具體方法為在定期更換培養基并去除臍帶組織后，繼續用改良鷹氏培養基-α維持培養，直到細胞擴增到3-5代，將人臍帶間充質干細胞擴增至10層的細胞培養室。
10、其中，所述差速離心步驟中去除細胞、細胞碎片和凋亡殘留物具體離心的過程如下：750g離心力離心10分鐘，3000g離心力離心20分鐘，12000g離心力離心45分鐘。
11、本專利技術另一目的是提供一種上述的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，所述人臍帶間充質干細胞外泌體的鑒定方法是通過透射電子顯微鏡、納米粒子跟蹤分析和納米流式技術進行鑒定，所述納米流式技術分析外泌體蛋白標記物的表達情況，具體表達包括以下：cd9、cd63、cd81表達陽性；所述透射電子顯微鏡用于觀察人臍帶間充質干細胞的外泌體形態特征。
12、其中，所述透射電子顯微鏡觀察的具體步驟如下：
13、固定：樣品先用2.5％戊二醛預固定，然后用1％的四氧化鋨后固定；
14、脫水：樣品逐步用丙酮脫水，脫水劑濃度梯度為30％→50％→70％→80％→90％→95％→100％；
15、滲透：將脫水劑和epon-812包埋介質按3:1、1:1和1:3的比例混合，依次滲透；
16、包埋：樣品用純epon-812包埋介質包埋；
17、半薄定位和超薄切片：在光鏡下選擇小鼠肺組織肺泡區域，用超薄切片機切割60～90nm的超薄切片，并收集在銅網上；
18、染色：切片先用烏洛托品酸鹽染色10～15分鐘，然后用檸檬酸鉛染色1～2分鐘。
19、本專利技術進一步設置為：所述人臍帶間充質干細胞外泌體通過促進相關蛋白的表達進而促進肺發育，所述蛋白包括成熟的肺泡蛋白spb、spc以及atp結合盒轉運蛋白a3。
20、本專利技術進一步設置為：足月嬰兒臍帶間充質干細胞外泌體相比于早產嬰兒臍帶間充質干細胞外泌體可以通過調控wnt5a/rock1途徑促進rhoa的表達來加速肺發育進程。
21、其中，所述wnt5a/rock1途徑具體為足月嬰兒臍帶間充質干細胞外泌體通過自然富集的wnt5a直接調節肺組織中rock1的磷酸化，促進肺泡ⅱ型細胞的自噬和板層小體的發展，促進肺泡化并降低早產兒bpd的發病率。
22、通過采用上述技術方案，本專利技術發現足月嬰兒臍帶間充質干細胞外泌體通過富含wnt5a，激活非典型wnt信號途徑，特別是wnt5a/rock1途徑，促進了肺泡ⅱ型細胞的分化、遷移及自我修復能力，wnt5a直接與rock1相互作用，通過磷酸化rock1，加速肌動蛋白細胞骨架重組，進一步增強肺泡形成和成熟的過程；
23、足月嬰兒臍帶間充質干細胞外泌體通過促進lbs的形成及其相關蛋白(spc、spb、abca3)的表達，加速了肺泡表面活性劑的合成，表面活性劑的增加能夠有效維持肺泡的表面張力，防止肺泡塌陷，并維持肺泡的正常結構與功能，這對于早產兒的肺發育尤為重要；
24、足月嬰兒臍帶間充質干細胞外泌體通過改善rhoa的表達，增強了自噬相關蛋白lc3b的表達，促進了at2細胞自噬過程中的lbs發育，有助于肺泡細胞穩定性和肺表面活性劑的生成，自噬增強與lbs形成緊密相關，表明足月exos通過rhoa及自噬機制進一步促進了肺的發育和成熟。
25、足月嬰兒臍帶間充質干細胞外泌體通過改善肺泡化、加速肺泡成熟及促進表面活性劑的合成，為早產兒呼吸問題，尤其是支氣管肺發育不良(bpd)的治療提供了新思路和潛在療法。這一機制減少了藥物副作用，并增強了肺組織自我修復能力，使早產兒更快地恢復正常肺功能。
26、綜上所述，本專利技術具有以下有益效果：
27、1.本專利技術的人臍帶間充質干細胞外泌體通過其富含的wnt5a顯著促進了肺泡化的過程，加速了肺泡的發育和成熟，改善了肺泡結構和肺功能，該作用對早產兒的肺部發育及呼吸問題提供了有效的干預手段；人臍帶間充質干細胞外泌體通過激活wnt5a/rock1途徑，增強了肺泡上皮細胞的分化和本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，其特征是：所述人臍帶間充質干細胞外泌體的制備過程包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，其特征是：所述維持培養的具體方法為在定期更換培養基并去除臍帶組織后，繼續用改良鷹氏培養基-α維持培養，直到細胞擴增到3-5代，將人臍帶間充質干細胞擴增至10層的細胞培養室。
3.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，其特征是：所述差速離心步驟中去除細胞、細胞碎片和凋亡殘留物具體離心的過程如下：750g離心力離心10分鐘，3000g離心力離心20分鐘，12000g離心力離心45分鐘。
4.一種如權利要求1-3任一項所述的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，其特征是：所述人臍帶間充質干細胞外泌體的鑒定方法是通過透射電子顯微鏡、納米粒子跟蹤分析和納米流式技術進行鑒定，所述納米流式技術分析外泌體蛋白標記物的表達情況，具體表達包括以下：CD9、CD63、CD81表達陽性；所述透射電子顯微鏡用于觀察人臍帶間充質干細胞的外泌體形態特征。p>
5.根據權利要求4所述的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，其特征是：所述透射電子顯微鏡觀察的具體步驟如下：
6.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，其特征是：所述人臍帶間充質干細胞外泌體通過促進相關蛋白的表達進而促進肺發育，所述蛋白包括成熟的肺泡蛋白SPB、SPC以及ATP結合盒轉運蛋白A3。
7.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，其特征是：足月嬰兒臍帶間充質干細胞外泌體相比于早產嬰兒臍帶間充質干細胞外泌體可以通過調控Wnt5a/ROCK1軸促進RhoA的表達來加速肺發育進程。
8.根據權利要求7所述的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用及驗證方法，其特征是：所述Wnt5a/ROCK1途徑具體為足月嬰兒臍帶間充質干細胞外泌體通過自然富集的Wnt5a直接調節肺組織中ROCK1的磷酸化，促進肺泡Ⅱ型細胞的自噬和板層小體的發展，促進肺泡化并降低早產兒BPD的發病率。
...【技術特征摘要】
1.人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，其特征是：所述人臍帶間充質干細胞外泌體的制備過程包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，其特征是：所述維持培養的具體方法為在定期更換培養基并去除臍帶組織后，繼續用改良鷹氏培養基-α維持培養，直到細胞擴增到3-5代，將人臍帶間充質干細胞擴增至10層的細胞培養室。
3.根據權利要求1所述的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，其特征是：所述差速離心步驟中去除細胞、細胞碎片和凋亡殘留物具體離心的過程如下：750g離心力離心10分鐘，3000g離心力離心20分鐘，12000g離心力離心45分鐘。
4.一種如權利要求1-3任一項所述的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進肺發育中的應用，其特征是：所述人臍帶間充質干細胞外泌體的鑒定方法是通過透射電子顯微鏡、納米粒子跟蹤分析和納米流式技術進行鑒定，所述納米流式技術分析外泌體蛋白標記物的表達情況，具體表達包括以下：cd9、cd63、cd81表達陽性；所述透射電子顯微鏡...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李欣，張海洋，劉瀚旻，母得志，唐軍，
申請(專利權)人：四川大學華西第二醫院，
類型：發明
國別省市：
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