【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物化學(xué)，涉及一類以kwwk為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽，本專利技術(shù)同時(shí)還涉及該抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、抗生素耐藥性給世界公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅，但是美國食品藥品管理局開發(fā)和批準(zhǔn)的新抗生素卻很少。據(jù)估計(jì)，開發(fā)一種新型抗生素的成本約為15億美元，且從基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)到fda批準(zhǔn)需要10年以上。抗菌肽(amps)因其獨(dú)特的作用于細(xì)菌膜的機(jī)制而不易產(chǎn)生耐藥性，是一種有潛力的抗生素。但是amps存在一些固有的缺陷，如難以兼具高抗菌活性、低毒性和高穩(wěn)定性以及成本高昂。因此，迫切需要開發(fā)序列簡單、易于合成的新型抗菌肽。
2、親水性和疏水性是影響陽離子amps抗菌活性和毒性的關(guān)鍵因素，陽離子有助于amps與細(xì)菌膜帶負(fù)電荷的區(qū)域結(jié)合，疏水部分促進(jìn)amps插入細(xì)菌膜的疏水磷脂層中。疏水性氨基酸和陽離子氨基酸交替排列能夠促進(jìn)amps形成一面親水、一面疏水的兩親性表面，而“k”和“w”作為黃金組合被應(yīng)用在很多amps的設(shè)計(jì)中。一些研究表明，具有重復(fù)序列且對(duì)稱的amps具有高效的抗菌活性和低毒性。因此申請(qǐng)人最初設(shè)計(jì)的肽是將“wk”重復(fù)兩次且對(duì)稱分布在兩側(cè)，為了提高肽的抗菌活性，將能夠與細(xì)菌膜發(fā)生強(qiáng)烈相互作用的色氨酸重復(fù)兩次作為肽的對(duì)稱中心，因而得到抗菌肽wkwkwwkwkw-nh2(n2w2)，n2w2具有高效廣譜的抗菌活性，但是它的溶血活性較高。有研究表明，疏水性過高會(huì)導(dǎo)致溶血活性的增加，而n2w2的疏水性高達(dá)0.954，因此適當(dāng)降低其疏水性或許能夠改善其毒性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路b>
1、本專利技術(shù)的目的之一是降低以“ww”為對(duì)稱中心，“wk”序列重復(fù)兩次且對(duì)稱分布在兩側(cè)的n2w2(wkwkwwkwkw-nh2)的毒性，提供一類以n2w2為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)而衍生的抗菌肽。
2、本專利技術(shù)的目的之二是提供上述抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用。
3、為實(shí)現(xiàn)其目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：
4、一、一類以ww為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
5、本專利技術(shù)提供的一類以ww為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽，是將wk重復(fù)兩次且對(duì)稱分布在兩側(cè)，并以ww作為對(duì)稱中心，得到抗菌肽
6、wkwkwwkwkw-nh2(n2w2)，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示；然后將n2w2的c末端和n末端的色氨酸替換為亮氨酸和/或異亮氨酸得到：
7、即，所述抗菌肽為lkwkwwkwkl-nh2，標(biāo)記為ll-n2w2，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示；
8、或：ikwkwwkwkl-nh2，標(biāo)記為il-n2w2，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示；
9、或：ikwkwwkwki-nh2，標(biāo)記為ii-n2w2，其氨基酸序列如seq?id?no.4所示；
10、或：lkwkwwkwki-nh2，標(biāo)記為li-n2w2，其氨基酸序列如seq?id?no.5所示。
11、作為本專利技術(shù)技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)選，所述抗菌肽為：ikwkwwkwkl-nh2，標(biāo)記為il-n2w2，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
12、因?yàn)閕l-n2w2具有最高的抗菌活性和低溶血活性，為了提高穩(wěn)定性，進(jìn)一步地，將il-n2w2序列中所有氨基酸進(jìn)行d型氨基酸替換，得到新的抗菌肽，其結(jié)構(gòu)式為d-ile-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-leu-nh2，標(biāo)記為d-il-n2w2。
13、上述新設(shè)計(jì)的抗菌肽均采用經(jīng)典固相合成法制備得到。
14、二、一類以ww為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用
15、1、體外抑菌實(shí)驗(yàn)
16、為了評(píng)價(jià)上述新設(shè)計(jì)的抗菌肽的體外抗菌活性，采用微量肉湯稀釋法測試肽的最低抑菌濃度。將肽用二倍稀釋法配制256μm～2μm的梯度濃度的肽儲(chǔ)備液，將生長至對(duì)數(shù)期的細(xì)菌用mh肉湯稀釋至1×105cfu/ml，等體積肽液和菌液被加入96孔板在37℃孵育18h，肉眼觀察無細(xì)菌生長的最低肽濃度即為該肽對(duì)該細(xì)菌的最低抑菌濃度。此實(shí)驗(yàn)以多粘菌素b，環(huán)丙沙星和鏈霉素為陽性對(duì)照，測試進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)，每次三個(gè)平行。檢測結(jié)果見表1。
17、表1本專利技術(shù)抗菌肽對(duì)常見標(biāo)準(zhǔn)菌株的最低抑菌濃度(μm)
18、
19、表1結(jié)果顯示，本專利技術(shù)抗菌肽對(duì)以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性菌，以及對(duì)以肺炎克雷伯桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌為代表的革蘭氏陰性菌都具有很好的抗菌效果，表現(xiàn)為廣譜抗菌活性，其中，il-n2w3抗菌活性最高。
20、2、溶血活性實(shí)驗(yàn)
21、為了評(píng)價(jià)本專利技術(shù)新設(shè)計(jì)的抗菌肽對(duì)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞的毒性，將抗菌肽用pbs二倍稀釋后與小鼠紅細(xì)胞(8％v/v)等體積在37℃孵育1h后檢測上清液的吸光度，以1％?tritonx-100為陽性對(duì)照，pbs為陰性對(duì)照，溶血率結(jié)果見圖1。
22、圖1結(jié)果顯示，母肽n2w2在128μm的濃度時(shí)就引起了10％以上的溶血，而經(jīng)過末端氨基酸替換的類似物溶血活性顯著降低，在1024μm時(shí)仍低于10％，說明本專利技術(shù)提供的抗菌肽具有良好的生物相容性。
23、3、酶解穩(wěn)定性測定
24、為了評(píng)價(jià)本專利技術(shù)抗菌肽的穩(wěn)定性，將終濃度為2×mic的抗菌肽與不同濃度的胰蛋白酶或糜蛋白酶共同在37℃孵育1h后，60℃將酶滅活(15min)，然后檢測肽對(duì)細(xì)菌的抑菌活性的變化，結(jié)果見圖2。
25、圖2結(jié)果顯示，n2w3在與0.1μg/ml的糜蛋白酶或胰蛋白酶孵育1h后對(duì)細(xì)菌的抑制能力就喪失了50％以上，與1μg/ml及以上濃度的酶孵育時(shí)就完全喪失了抑菌能力，表明n2w3非常容易被酶降解，穩(wěn)定性很差。經(jīng)過末端氨基酸替換得到的ll-n2w3，il-n2w3，ii-n2w3，li-n2w3的酶解穩(wěn)定性結(jié)果與n2w3的結(jié)果相似，都對(duì)胰蛋白酶和糜蛋白酶表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性。而對(duì)抗菌活性最高的il-n2w3進(jìn)行d型氨基酸替換得到的d-il-n2w3，與最高測試濃度1000μg/ml的酶孵育后依然能夠完全抑制細(xì)菌的生長，說明d-il-n2w3具有優(yōu)異的酶解穩(wěn)定性。
26、本專利技術(shù)設(shè)計(jì)了以“ww”為對(duì)稱中心，“wk”重復(fù)序列對(duì)稱分布的肽n2w2(wkwkwwkwkw-nh2)，并通過末端氨基酸替換的方法來降低其毒性，用亮氨酸和/或異亮氨酸替換n2w2的c末端和n末端的色氨酸，得到的4條抗菌肽均能夠基本保持母肽優(yōu)異的抗菌活性，并且它們的溶血活性大幅度降低，提升了安全性。其中il-n2w2的抗菌活性最高，但是穩(wěn)定性有待提升，因此對(duì)il-n2w2進(jìn)行d型氨基酸替換得到d-il-n2w2。d-il-n2w2保持了il-n2w2的高抗菌活性和低毒性，且與高濃度胰蛋白酶或糜蛋白酶孵育后仍然能夠完全抑制細(xì)菌生長，在緩解抗生素耐藥性方面具有非常大的潛力，在制備臨床抗菌藥物中具有很好的應(yīng)用前景。
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1.一類以WW為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽是將WK重復(fù)兩次且對(duì)稱分布在兩側(cè)，并以WW作為對(duì)稱中心，得到抗菌肽WKWKWWKWKW-NH2(N2W2)，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示；然后將N2W2的C末端和N末端的色氨酸替換為亮氨酸和/或異亮氨酸得到：
2.如權(quán)利要求1所述的一類以WW為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽為IKWKWWKWKL-NH2，標(biāo)記為IL-N2W2，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示。
3.如權(quán)利要求2所述的一類以WW為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽是將IL-N2W2序列中所有L型氨基酸替換為D型氨基酸得到，其結(jié)構(gòu)式為DIDKDWDKDWDWDKDWDKDL-NH2，標(biāo)記為D-IL-N2W2。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一類以WW為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的一類以WW為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述低毒廣譜抗菌肽抑制的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性
6.如權(quán)利要求5所述的一類以WW為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌，所述的革蘭氏陰性菌為大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一類以ww為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽是將wk重復(fù)兩次且對(duì)稱分布在兩側(cè)，并以ww作為對(duì)稱中心，得到抗菌肽wkwkwwkwkw-nh2(n2w2)，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示；然后將n2w2的c末端和n末端的色氨酸替換為亮氨酸和/或異亮氨酸得到：
2.如權(quán)利要求1所述的一類以ww為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽為ikwkwwkwkl-nh2，標(biāo)記為il-n2w2，其氨基酸序列如seq?id?no.3所示。
3.如權(quán)利要求2所述的一類以ww為對(duì)稱中心的低毒廣譜抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽是將il-n2w2序列中所有l(wèi)型氨基酸替換為...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：倪京滿，王銳，李貝貝，緱三虎，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：蘭州大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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