【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于基因工程和微生物，具體涉及一種利用調(diào)控分裂基因構(gòu)建多倍體谷氨酸棒桿菌的方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、公開該
技術(shù)介紹
部分的信息僅僅旨在增加對本專利技術(shù)的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
2、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)是近四十年來全球用以氨基酸發(fā)酵工業(yè)的主要生產(chǎn)菌，早在1957年由kinoshita首次描述其為谷氨酸產(chǎn)生菌。其具有公認(rèn)食品安全(gras)的特性，已成為工業(yè)生產(chǎn)的模式微生物之一，被應(yīng)用于構(gòu)建綠色高效的微生物細(xì)胞工廠。
3、據(jù)報道，谷氨酸棒桿菌年產(chǎn)氨基酸超過600萬t，主要產(chǎn)品包括l-谷氨酸、l-賴氨酸、支鏈氨基酸和l-脯氨酸等。近年來，其已經(jīng)被廣泛用于化學(xué)品、燃料、材料、天然產(chǎn)物以及重組蛋白的生產(chǎn)。然而，從自然界中分離得到的谷氨酸棒桿菌，其性狀遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，因此如何對微生物底盤進行提升，以獲得高產(chǎn)高效的工業(yè)微生物細(xì)胞工廠就成為了工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵。
4、在合成生物學(xué)領(lǐng)域，研究人員通過對谷氨酸棒桿菌進行代謝工程改造，從而提高其產(chǎn)氨基酸能力。比如基于生物合成元件及代謝途徑的挖掘和優(yōu)化。細(xì)胞進化的趨勢是從單倍體細(xì)胞到多倍體細(xì)胞，且染色體數(shù)量的增多有效提升其遺傳多樣性，從而增強細(xì)胞對環(huán)境壓力的耐受性。且在多倍體細(xì)胞中，基因冗余的存在可阻止那些可能在其他染色體上逃逸并持續(xù)存在的有害突變，確保了細(xì)胞的穩(wěn)定生存。此外，染色體數(shù)量的增加還深刻影響了細(xì)胞的整體轉(zhuǎn)錄活動
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供一種利用調(diào)控分裂基因構(gòu)建多倍體谷氨酸棒桿菌的方法及應(yīng)用。本專利技術(shù)通過試驗研究發(fā)現(xiàn)，ftsz是控制細(xì)胞分裂的主要基因，它以形成“z環(huán)”的形式招募其他分裂蛋白進行精密的調(diào)控細(xì)胞分裂過程。ftsz的弱表達低于其閾值可以阻止細(xì)胞分裂，從而阻止新一輪的染色體復(fù)制，同時仍然允許完成正在進行的復(fù)制過程。這種細(xì)胞成絲狀生長，并含有數(shù)量增加的不正確分離的染色體，絲狀細(xì)胞中的染色體呈絲狀延伸分布于胞內(nèi)。然而，長期抑制分裂會導(dǎo)致絲狀細(xì)胞由于細(xì)胞周期停止運行而最終被裂解。相反，ftsz的強表達使細(xì)胞在正常分裂和染色體分離的情況下存活。因此，通過調(diào)節(jié)ftsz的表達水平到適當(dāng)?shù)臐舛龋瑥亩晒?gòu)建多倍體谷氨酸棒桿菌。基于上述研究成果，從而完成本專利技術(shù)。
2、為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案如下：
3、本專利技術(shù)的第一個方面，提供一種利用調(diào)控分裂基因構(gòu)建多倍體谷氨酸棒桿菌的方法，所述方法包括：在谷氨酸棒桿菌復(fù)制形成復(fù)制叉的過程中，將含有編碼抗生素抗性基因的分裂基因弱表達控制元件插入到其中一個復(fù)制叉染色體的分裂基因的起始密碼子之前，控制細(xì)胞在正常分裂的同時包含多條染色體，從而形成多倍體；其中，所述分裂基因具體為ftsz基因；所述控制元件中啟動子-rbs表達元件的表達強度為不大于200a.u.。
4、需要說明的是，在本專利技術(shù)中，雖然以谷氨酸棒桿菌為例，構(gòu)建獲得具有多倍體的谷氨酸棒桿菌，但是基于本申請的專利技術(shù)構(gòu)思，在其他單倍體生物中獲得對應(yīng)多倍體，同樣在本專利技術(shù)的保護范圍之內(nèi)。
5、本專利技術(shù)的第二個方面，提供上述方法構(gòu)建獲得的多倍體谷氨酸棒桿菌。
6、本專利技術(shù)的第三個方面，提供上述多倍體谷氨酸棒桿菌在制備生物基產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7、上述一個或多個技術(shù)方案的有益技術(shù)效果：
8、上述技術(shù)方案提供一種利用調(diào)控分裂基因構(gòu)建多倍體谷氨酸棒桿菌的方法，具體公開了通過調(diào)節(jié)分裂基因ftsz的表達水平到適當(dāng)?shù)臐舛龋瑥亩晒?gòu)建出多倍體谷氨酸棒桿菌，經(jīng)試驗驗證，獲得的多倍體谷氨酸棒桿菌與原始單倍體谷氨酸棒桿菌相比，其生長更慢，但是在cgxii培養(yǎng)基中培養(yǎng)至后期時，其生長更快；能增強蛋白質(zhì)的表達，較模式菌株atcc?13032具有更高的萜類積累，從而建立一種高效的底盤細(xì)胞來生產(chǎn)生物基產(chǎn)品，并可應(yīng)用于原核生物中染色體數(shù)量的增加對細(xì)胞影響的研究，具有良好的實際應(yīng)用之價值。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護點】
1.一種利用調(diào)控分裂基因構(gòu)建多倍體谷氨酸棒桿菌的方法，其特征在于，所述方法包括：在谷氨酸棒桿菌復(fù)制形成復(fù)制叉的過程中，將含有編碼抗生素抗性基因的分裂基因弱表達控制元件插入到其中一個復(fù)制叉染色體的分裂基因的起始密碼子之前，控制細(xì)胞在正常分裂的同時包含多條染色體，從而形成多倍體；所述分裂基因為ftsZ基因；所述控制元件中啟動子-UTR表達元件的表達強度為不大于200a.u.。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因包括卡那霉素抗性基因nptII、四環(huán)素抗性基因tetR和氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因CmR。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有編碼抗生素抗性基因的分裂基因弱表達控制元件具體由抗生素抗性基因-終止子-啟動子-UTR組成；所述控制元件中啟動子-UTR表達元件的表達強度為不大于200a.u.；進一步不大于150a.u.。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述終止子為rrnB?T1?Terminator。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述啟動子為表達強度較低的啟動子，包括P021、P0
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)環(huán)境中，施加所述抗生素抗性基因所對應(yīng)的抗生素形成篩選壓力。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所選用的谷氨酸棒桿菌為Corynebacteriumglutamicum?ATCC?13032。
8.權(quán)利要求1-7任一項所述方法構(gòu)建獲得的多倍體谷氨酸棒桿菌。
9.權(quán)利要求8所述多倍體谷氨酸棒桿菌在制備生物基產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，所述生物基產(chǎn)品包括蛋白質(zhì)、萜類和氨基酸。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種利用調(diào)控分裂基因構(gòu)建多倍體谷氨酸棒桿菌的方法，其特征在于，所述方法包括：在谷氨酸棒桿菌復(fù)制形成復(fù)制叉的過程中，將含有編碼抗生素抗性基因的分裂基因弱表達控制元件插入到其中一個復(fù)制叉染色體的分裂基因的起始密碼子之前，控制細(xì)胞在正常分裂的同時包含多條染色體，從而形成多倍體；所述分裂基因為ftsz基因；所述控制元件中啟動子-utr表達元件的表達強度為不大于200a.u.。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因包括卡那霉素抗性基因nptii、四環(huán)素抗性基因tetr和氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因cmr。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有編碼抗生素抗性基因的分裂基因弱表達控制元件具體由抗生素抗性基因-終止子-啟動子-utr組成；所述控制元件中啟動子-utr表達元件的表達強度為不大于200a.u.；進一步不大于150a.u.。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述終止子為rrnb?t1?terminator。
5.如權(quán)利要求1所述的...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：梁泉峰，靳鑫，祁慶生，
申請(專利權(quán))人：山東大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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