【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于化學檢測，尤其涉及一種亞硝胺的檢測方法。
技術介紹
1、煙草特有亞硝胺(tsnas)是一組只在煙草、煙制品及煙氣中發現的致癌物質。tsnas主要以4-n-亞硝基甲基氨-1-(3-吡啶基)丁酮(nnk)等形式呈現，具有強致癌性，現已被確認與肺部、口腔、食道、胃、胰臟、肝臟等部位的腫瘤形成有關。目前，全球范圍大約有13億煙民，而每年約有500～600萬人死于與吸煙有關的疾病。因此，當前對于tsnas的形成、致病機制和檢測技術等方面的研究一直是國內外研究的重點和熱點。
2、tsnas的檢測最早是利用薄層色譜法對卷煙煙氣中n-亞硝胺進行分析，但由于受儀器條件等因素的限制，使得tsnas的分析檢測結果一直很不理想。直到1975年熱能分析儀(tea)出現后，tsnas的檢測才得以改善。目前，檢測煙草及煙氣中tsnas較常用的分析方法主要有氣相色譜－熱能分析儀法(gc-tea)、氣相色譜－氮磷檢測法(gc-npd)、氣相色譜－質譜法(gc-ms)、液相色譜－串聯質譜法(hplc-ms/ms)和超高效液相色譜－電噴霧串聯質譜法(hplc-ms/ms)等。這些方法存在操作繁雜、檢測時間長及檢測成本較高等缺點，且對專業技術人員和儀器設備依賴程度高，很難做到微量快速檢測。此外，現有技術cn115453013a公開了一種富集和檢測煙草中4-甲基亞硝胺基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮的方法，但其先用用磁性樹枝狀分子印跡識別吸附材料分離并富集甲醇溶液中的nnk，最后還得利用高效液相色譜法檢測nnk。因此，對煙草、煙草產品及煙氣中的
3、近年來發展起來的熒光探針技術具有專一的選擇性、高效的靈敏度、簡便快速的操作、對檢測物損傷少等優點已被廣泛應用于檢測環境和生物體系中的常見重金屬、陰離子、以及活性硫、活性氧和活性硫等活性小分子領域。熒光探針檢測法不僅彌補了傳統大型儀器分析方法樣品試劑量要求大、實時在線分析困難、步驟繁瑣、不適合進行生物學及毒理學的研究等缺點，而且與傳統檢測方法相比表現出了很多的優勢。第一，具有專一的選擇性和特異性，可以實現對某些小分子和離子的專一性識別；第二，熒光探針法具有高效的靈敏度，從而使得該方法的最低檢出限要優于傳統的檢測方法，實現了對被檢測物的痕量檢測；第四，相比于傳統大型儀器檢測方法，熒光探針法具有操作簡單的優點，并且可以實現實時在線檢測，避免了傳統樣品在前處理階段的損耗以及其他干擾因素。因此，開發基于熒光探針的tsnas快速檢測方法在煙草和煙草產品的應用研究非常具有實用價值和科學意義。
技術實現思路
1、針對上述技術問題，本專利技術提出了一種檢測亞硝胺的熒光探針及其制備方法和應用。
2、為實現上述目的，本專利技術的技術方案是這樣實現的：
3、一種檢測亞硝胺的熒光探針，其結構式如下：
4、
5、上述的檢測亞硝胺的熒光探針的制備方法，合成路線如下：
6、
7、具體制備步驟如下：將2-(二苯基膦基)苯甲酸、n,n'-二異丙基碳二亞胺(dic)與4-二甲氨基吡啶(dmap)溶于二氯甲烷(dcm)中，隨后滴加含熒光素的二氯甲烷溶液，室溫攪拌反應后制得熒光探針p1。
8、進一步，上述2-(二苯基膦基)苯甲酸與熒光素的摩爾比為(2-8):1。
9、上述的檢測亞硝胺的熒光探針p1在檢測煙草中亞硝胺的應用。
10、熒光探針p1識別nnk的機理：探針p1溶液中加入nnk溶液，由于nnk結構中-n-n＝o的強氧化性，nnk結構中-n-n＝o可以與含三芳基磷的化合物1反應生成含磷氮葉立德的中間體(化合物2)，化合物2通過快速的分子內乙酰基轉換并水解生成含亞磺酸胺的化合物3和同時釋放出具有熒光的基團，就可以實現對nnk的快速高效識別。
11、一種檢測煙草中亞硝胺的方法，步驟如下：
12、(1)將的熒光探針p1溶于二甲基亞砜中配置探針溶液；將tris-hcl緩沖溶液與二甲基亞砜混合得到混合溶液a；用二甲基亞砜配制4-n-亞硝基甲基氨-1-(3-吡啶基)丁酮溶液；
13、(2)向混合溶液a中加入探針溶液，然后加入4-n-亞硝基甲基氨-1-(3-吡啶基)丁酮溶液，經超聲波清洗機超聲震蕩得檢測液；以490nm為激發波長，利用熒光光譜儀測定520nm處的熒光發射強度，得到4-n-亞硝基甲基氨-1-(3-吡啶基)丁酮濃度與熒光強度的工作曲線f520nm＝16.66c+2889.01，c的單位為μmol/l；
14、(3)將混合溶液a與探針溶液混合，加入待測樣品溶液；以490nm為激發波長，利用熒光光譜儀測定520nm處的熒光發射強度并帶入步驟(2)的工作曲線，即可對待測樣品溶液中的亞硝胺進行定量檢測。
15、上述步驟(1)中探針溶液的濃度為1-5mmol/l。例如，探針溶液的濃度為1-4mmol/l；探針溶液的濃度為2-5mmol/l；探針溶液的濃度為1mmol/l、2mmol/l、3mmol/l、4mmol/l或5mmol/l。
16、上述步驟(1)中tris-hcl緩沖溶液的濃度為20-50mmol/l，ph＝7.4。例如，tris-hcl緩沖溶液的濃度為20-40mmol/l；tris-hcl緩沖溶液的濃度為30-50mmol/l；tris-hcl緩沖溶液的濃度為20-30mmol/l；tris-hcl緩沖溶液的濃度為30-40mmol/l；tris-hcl緩沖溶液的濃度為40-50mmol/l；tris-hcl緩沖溶液的濃度為20mmol/l、30mmol/l、40mmol/l或50mmol/l。
17、上述步驟(1)混合溶液a中tris-hcl緩沖溶液與二甲基亞砜的體積比為(5-8):(2-5)。例如，混合溶液a中tris-hcl緩沖溶液與二甲基亞砜的體積比為(5-7):(2-4)；混合溶液a中tris-hcl緩沖溶液與二甲基亞砜的體積比為(6-8):(3-5)；混合溶液a中tris-hcl緩沖溶液與二甲基亞砜的體積比為(5-8):2；混合溶液a中tris-hcl緩沖溶液與二甲基亞砜的體積比為(5-8):3；混合溶液a中tris-hcl緩沖溶液與二甲基亞砜的體積比為(5-8):7；混合溶液a中tris-hcl緩沖溶液與二甲基亞砜的體積比為5:(2-5)；混合溶液a中tris-hcl緩沖溶液與二甲基亞砜的體積比為7:(2-5)；混合溶液a中tris-hcl緩沖溶液與二甲基亞砜的體積比為8:(2-5)；混合溶液a中tris-hcl緩沖溶液與二甲基亞砜的體積比1:1、5:2、4:1、8:5、7:3或2:1。
18、上述步驟(1)中4-n-亞硝基甲基氨-1-(3-吡啶基)丁酮溶液的濃度為2-15mmol/l。例如，4-n-亞硝基甲基氨-1-(3-吡啶基)丁酮溶液的濃度為2-5mmol/l；4-n-亞硝基甲基氨-1-(3-吡啶基)丁酮溶液的濃度為5本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種檢測亞硝胺的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針的結構式如下：
2.權利要求1所述的檢測亞硝胺的熒光探針的制備方法，其特征在于，步驟如下：將2-(二苯基膦基)苯甲酸、N,N'-二異丙基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷中，隨后滴加含熒光素的二氯甲烷溶液，室溫攪拌反應后制得熒光探針。
3.根據權利要求2所述的檢測亞硝胺的熒光探針的制備方法，其特征在于，所述2-(二苯基膦基)苯甲酸與熒光素的摩爾比為(2-8):1。
4.權利要求1所述的檢測亞硝胺的熒光探針在檢測煙草中亞硝胺的應用。
5.一種檢測煙草中亞硝胺的方法，其特征在于，步驟如下：
6.根據權利要求5所述的檢測煙草中亞硝胺的方法，其特征在于，所述步驟（1）中探針溶液的濃度為1-5?mmol/L；Tris-HCl緩沖溶液的濃度為20-50?mmol/L，pH=7.4。
7.根據權利要求6所述的檢測煙草中亞硝胺的方法，其特征在于，所述步驟（1）混合溶液A中Tris-HCl緩沖溶液與二甲基亞砜的體積比為(5-8):(?2-5)；4-N-亞硝基甲基氨-1-
8.根據權利要求7所述的檢測煙草中亞硝胺的方法，其特征在于，所述步驟（2）和步驟（3）中熒光探針的終濃度為10?μmol/L。
9.根據權利要求8所述的檢測煙草中亞硝胺的方法，其特征在于，所述步驟（2）4-N-亞硝基甲基氨-1-(3-吡啶基)丁酮在檢測液中的終濃度為0-45?μmol/L。
10.根據權利要求9所述的檢測煙草中亞硝胺的方法，其特征在于，所述步驟（2）和（3）中熒光光譜儀測定時，激發波長為490?nm。
...【技術特征摘要】
1.一種檢測亞硝胺的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針的結構式如下：
2.權利要求1所述的檢測亞硝胺的熒光探針的制備方法，其特征在于，步驟如下：將2-(二苯基膦基)苯甲酸、n,n'-二異丙基碳二亞胺與4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷中，隨后滴加含熒光素的二氯甲烷溶液，室溫攪拌反應后制得熒光探針。
3.根據權利要求2所述的檢測亞硝胺的熒光探針的制備方法，其特征在于，所述2-(二苯基膦基)苯甲酸與熒光素的摩爾比為(2-8):1。
4.權利要求1所述的檢測亞硝胺的熒光探針在檢測煙草中亞硝胺的應用。
5.一種檢測煙草中亞硝胺的方法，其特征在于，步驟如下：
6.根據權利要求5所述的檢測煙草中亞硝胺的方法，其特征在于，所述步驟（1）中探針溶液的濃度為1-5?mmol/l；tris-hcl緩沖溶液的濃度...
【專利技術屬性】
技術研發人員：付博，張迪，葉晨晨，李漫，王靜，王歡歡，武云杰，張曉平，
申請(專利權)人：河南農業大學，
類型：發明
國別省市：
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