【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及類器官構(gòu)建，尤其涉及一種心臟類器官的構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
1、心臟是人體的重要器官，它的基本功能是推動血液流動，向器官、組織提供充足的血流量，以供應(yīng)氧和各種營養(yǎng)物質(zhì)，并帶走代謝的終產(chǎn)物，使細(xì)胞維持正常的代謝和功能。血管疾病，如心肌梗死和心力衰竭，已成為全球死亡的主要原因。隨著人類年齡的增長，心臟功能下降給人類健康帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。深入研究心血管疾病的發(fā)病機制、提高心血管疾病的診療水平以及開發(fā)新型藥物成為學(xué)者們關(guān)注的焦點。
2、長期以來，二維細(xì)胞模型和動物模型一直被用來研究心血管疾病。然而，這些傳統(tǒng)模型都有著自身局限性，并不完全適用于心血管疾病的研究。如2d細(xì)胞模型無基質(zhì)成分和器官特異性功能，以及在多次傳代后原始細(xì)胞的遺傳異質(zhì)性逐漸喪失。動物模型與人類之間存在種屬差異性，具有不同的結(jié)構(gòu)和生理學(xué)，并且具有不同的特異性器官發(fā)育和發(fā)病機制。
3、相比于上述兩種研究模型，類器官作為一種新的體外細(xì)胞模型，具有復(fù)雜三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)，它顯示出與體內(nèi)器官相似的結(jié)構(gòu)和功能。心臟類器官是對傳統(tǒng)心血管疾病模型的有效補充，在體外更真實和準(zhǔn)確地反映人體心臟的生物學(xué)特性和功能，使其在疾病機制研究、藥物開發(fā)、精準(zhǔn)醫(yī)療和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景和獨特優(yōu)勢。目前已報道過一些由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ips)構(gòu)建心臟類器官的方法，但這些方法步驟較為復(fù)雜，至少需要依次采用3種培養(yǎng)基進行多階段分化培養(yǎng)，且構(gòu)建心臟類器官所需時間較長。例如專利cn118345031a中需要一次使用三種培養(yǎng)基，進行三個階段分化培養(yǎng)，才能由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞構(gòu)建
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決上述技術(shù)問題，即現(xiàn)有的由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞構(gòu)建心臟類器官的方法步驟復(fù)雜，且所需時間較長，操作難度較大，本專利技術(shù)提供了一種心臟類器官的構(gòu)建方法。在本專利技術(shù)的方法中，依次使用2種培養(yǎng)基進行兩個階段分化培養(yǎng)，即可由消化后離散的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞構(gòu)建得到心臟類器官，簡化了心臟類器官的構(gòu)建過程，縮短了構(gòu)建時間，并降低了操作難度。
2、本專利技術(shù)的具體技術(shù)方案為：
3、一種心臟類器官的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
4、s1：配制含cd脂質(zhì)(cd?lipid)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇(its-x)、l-抗壞血酸-2-磷酸(l-aa2p)、1-硫代甘油(α-mtg)、胰島素(insulin)、成纖維細(xì)胞生長因子2(fgf2)和糖原合成酶激酶-3β(gsk-3β)抑制劑的培養(yǎng)基i；
5、s2：配制含cd脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和血管內(nèi)皮生長因子a(vegfa)的培養(yǎng)基ii；
6、s3：將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞團消化后，懸浮于培養(yǎng)基i中，再接種至孔底為u形的超低吸附細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)36～40h時，去除培養(yǎng)基i，加入培養(yǎng)基ii，培養(yǎng)至形成心臟類器官。
7、在由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞構(gòu)建類器官的過程中，培養(yǎng)基中的各種成分會對細(xì)胞的生長和分化產(chǎn)生錯綜復(fù)雜的影響。本專利技術(shù)依次采用含有特定成分的培養(yǎng)基i和培養(yǎng)基ii進行培養(yǎng)，并在特定的時間點(即采用培養(yǎng)基i培養(yǎng)36～40h時)將培養(yǎng)基i換成培養(yǎng)基ii，能夠成功構(gòu)建得到心臟類器官。采用本專利技術(shù)的方法，僅需使用兩種培養(yǎng)基，培養(yǎng)11.5天左右(第一階段分化培養(yǎng)36h左右，第二階段分化培養(yǎng)10天左右)，即可由人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞構(gòu)建獲得心臟類器官，簡化了心臟類器官的構(gòu)建步驟，縮短了構(gòu)建時間；并且，在本專利技術(shù)的方法中，心臟類器官可由消化后離散的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞構(gòu)建得到，無需在使用培養(yǎng)基i進行培養(yǎng)前，使人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞預(yù)先形成細(xì)胞球并保持細(xì)胞球的形態(tài)，這能夠在更大程度上簡化心臟類器官的構(gòu)建過程，降低操作難度。
8、作為優(yōu)選，步驟s1具體包括：將cd脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和糖原合成酶激酶-3β抑制劑加入到dmem/f12培養(yǎng)基中，混勻，得到培養(yǎng)基i。
9、作為優(yōu)選，步驟s2具體包括：將cd脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和血管內(nèi)皮生長因子a加入到dmem/f12培養(yǎng)基中，混勻，得到培養(yǎng)基ii。
10、作為優(yōu)選，步驟s1中，所述培養(yǎng)基i中，cd脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和糖原合成酶激酶-3β抑制劑的濃度分別為0.5×～2×、0.5×～2×、100～200ng/ml、350～450μm、1～5μg/ml、10～30ng/ml和1～10μm。
11、作為優(yōu)選，步驟s2中，所述培養(yǎng)基ii中，cd脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和血管內(nèi)皮生長因子a的濃度分別為0.5×～2×、0.5×～2×、100～200ng/ml、350～450μm、1～5μg/ml、10～30ng/ml和100～200ng/ml。
12、培養(yǎng)基i和培養(yǎng)基ii中各成分的濃度會影響細(xì)胞的生長和分化，進而影響心臟類器官的形成。本專利技術(shù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩種培養(yǎng)基中1-硫代甘油的濃度不在350～450μm范圍內(nèi)時，會造成心臟類器官構(gòu)建效果不佳。
13、作為優(yōu)選，步驟s3中，采用干細(xì)胞消化液消化人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞團。
14、作為優(yōu)選，步驟s3中，所述人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞團的制備方法包括以下步驟：將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞團接種至培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到73～78％。
15、作為優(yōu)選，步驟s3中，懸浮于培養(yǎng)基i中的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞團按照0.5×104～1.0×104個/cm2的細(xì)胞密度接種至孔底為u形的超低吸附細(xì)胞培養(yǎng)板中。
16、作為優(yōu)選，步驟s3中，所述培養(yǎng)至形成心臟類器官的時間為240～280h。
17、作為優(yōu)選，步驟s3中，所述培養(yǎng)至形成心臟類器官的過程中，每45～50h更換一次培養(yǎng)基ii。
18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點：
19、(1)本專利技術(shù)中，通過采用特定的培養(yǎng)基成分以及更換培養(yǎng)基的時機，能夠在僅依次使用2種培養(yǎng)基進行兩個階段分化培養(yǎng)的情況下，由消化后離散的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞構(gòu)建得到心臟類器官，能夠簡化心臟類器官的構(gòu)建過程，縮短構(gòu)建時間，降低操作難度。
20、(2)本專利技術(shù)中，通過控制兩種培養(yǎng)基中各成分的濃度，能夠使各成分之間較好地配合，使細(xì)胞按照理想的情況生長和分化，實現(xiàn)較好的心臟類器官構(gòu)建效果。
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1.一種心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S1具體包括：將CD脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、L-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和糖原合成酶激酶-3β抑制劑加入到DMEM/F12培養(yǎng)基中，混勻，得到培養(yǎng)基I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S2具體包括：將CD脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、L-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和血管內(nèi)皮生長因子A加入到DMEM/F12培養(yǎng)基中，混勻，得到培養(yǎng)基II。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S1中，所述培養(yǎng)基I中，CD脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、L-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和糖原合成酶激酶-3β抑制劑的濃度分別為0.5×~2×、0.5×~2×、100~200?ng/mL、350~450?μM、1~5?μg/mL、10~30?ng/mL和1~1
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S2中，所述培養(yǎng)基II中，CD脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、L-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和血管內(nèi)皮生長因子A的濃度分別為0.5×~2×、0.5×~2×、100~200?ng/mL、350~450?μM、1~5?μg/mL、10~30?ng/mL和100~200?ng/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S3中，采用干細(xì)胞消化液消化人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞團。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S3中，所述人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞團的制備方法包括以下步驟：將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞團接種至培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到73~78%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S3中，懸浮于培養(yǎng)基I中的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞團按照0.5×104~1.0×104個/cm2的細(xì)胞密度接種至孔底為U形的超低吸附細(xì)胞培養(yǎng)板中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S3中，所述培養(yǎng)至形成心臟類器官的時間為240~280?h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S3中，所述培養(yǎng)至形成心臟類器官的過程中，每45~50?h更換一次培養(yǎng)基II。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s1具體包括：將cd脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和糖原合成酶激酶-3β抑制劑加入到dmem/f12培養(yǎng)基中，混勻，得到培養(yǎng)基i。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s2具體包括：將cd脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和血管內(nèi)皮生長因子a加入到dmem/f12培養(yǎng)基中，混勻，得到培養(yǎng)基ii。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s1中，所述培養(yǎng)基i中，cd脂質(zhì)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗壞血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰島素、成纖維細(xì)胞生長因子2和糖原合成酶激酶-3β抑制劑的濃度分別為0.5×~2×、0.5×~2×、100~200?ng/ml、350~450?μm、1~5?μg/ml、10~30?ng/ml和1~10?μm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的心臟類器官的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s2中，所述培養(yǎng)基ii中，cd脂...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李偉，趙婧，張勇，李春啟，蔣明，
申請(專利權(quán))人：杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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