【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于物質(zhì)含量檢測方領(lǐng)域，具體涉及一種高效液相色譜測定軟膠囊中大豆磷脂的兩個組分大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺含量的方法。
技術(shù)介紹
1、磷脂是維持植物和動物細(xì)胞正常生長和生命活動的重要生物化學(xué)中間體，幾乎所有生物的細(xì)胞中都含有磷脂。植物磷脂主要來源于油料的種子如大豆、油菜籽、葵花籽等，其種類主要包括磷脂酰膽堿（pc）、磷脂酰乙醇胺（pe）、磷脂酰肌醇（pi）、磷脂酰絲氨酸（ps）等。磷脂是一類含磷的類脂類生理活性物質(zhì)，具有促進(jìn)細(xì)胞生長、促進(jìn)脂肪代謝、調(diào)節(jié)血脂、健腦益智、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等特殊的生理功能，是構(gòu)成人和許多動植物組織的重要成分，在生命活動中發(fā)揮著重要的功能。磷脂為兩性的天然表面活性物質(zhì)，具有乳化、分散、潤濕、脫模、分離等作用，精制的天然磷脂可用作制備各種藥物制劑的輔料。大豆磷脂作為乳化劑用于乳劑藥物，乳劑藥物分散度大、吸收快、起效快、具有靶向性，有利于提高生物利用度。由于磷脂無毒、無刺激、生物相容性好，而且本身具有良好的生理活性、是天然的優(yōu)良乳化劑，因此在制備乳劑藥物時，首選磷脂作為乳化劑，pc含量高的磷脂常用來制備水包油(o/w)型乳劑，例如脂肪乳、抗癌藥物鴉膽子油乳劑等。大豆磷脂作為脂質(zhì)體膜材用于制備脂質(zhì)體，脂質(zhì)體具有靶向性和淋巴定向性、緩釋作用、降低藥物毒性、提高主藥穩(wěn)定性等特點，在臨床上常作為抗腫瘤藥物、抗寄生蟲藥物、抗菌藥物、激素類藥物等藥物的載體。磷脂是形成脂質(zhì)體的重要材料。大豆磷脂作為穩(wěn)定劑用于混懸劑、氣體分散劑、固體分散級等藥物，磷脂為兩性的天然表面活性物質(zhì)，具有乳化、分散、潤濕、脫模、分離等作
2、目前，分析磷脂含量的方法不少，主要有丙酮不溶物法、測磷法（包括鉬藍(lán)比色法、濕法氧化法）、紫外可見分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜（hplc）法、質(zhì)譜分析法等。其中，丙酮不溶物法測得數(shù)值還包括非磷的糖脂等，只能較粗略地反映磷脂的含量；測磷法及紫外可見分光光度法不能準(zhǔn)確地測定出不同類型磷脂（如大豆磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等）的相對含量；薄層色譜法檢測較低含量的待測物質(zhì)，專屬性和精密度不好。采用hplc-ms/ms進(jìn)行定量，首先要將被分析物電離，難電離的化合物無法檢測，對儀器試劑等要求非常高，相應(yīng)的成本非常高。
3、國家標(biāo)準(zhǔn)gb5009.272-2016、gb/35867-2018、《中國藥典》中均采用高效液相色譜進(jìn)行不同類型磷脂含量的測定，且均采用了正己烷、異丙醇以及弱酸作為流動相。更為重要的是，這些流動相下磷脂酰乙醇胺出峰很早，會受到軟膠囊內(nèi)容物的其他組分的干擾，而大豆磷脂酰膽堿的出峰時間長等現(xiàn)象。
4、鑒于上述原因，有必要對國家標(biāo)準(zhǔn)中的色譜分析條件進(jìn)一步完善，開發(fā)一種優(yōu)化的軟膠囊內(nèi)容物中大豆磷脂的兩個組分大豆磷脂酰膽堿及磷脂酰乙醇胺含量的方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是，克服以上
技術(shù)介紹
中提到的不足和缺陷，提供一種高效液相色譜測定軟膠囊內(nèi)容物中大豆磷脂的兩個組分大豆磷脂酰膽堿及磷脂酰乙醇胺含量的方法，專屬性、精密度和準(zhǔn)確度更高，重現(xiàn)性更好。
2、本專利技術(shù)的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
3、一種軟膠囊中大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺含量的測定方法，包括如下步驟：
4、（1）分別稱取大豆磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品和磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品，用溶劑溶解并定容，分別配制成不同濃度梯度的大豆磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液和磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
5、（2）稱取軟膠囊內(nèi)容物待測樣品，用溶劑溶解并定容，濾過后取續(xù)濾液，得到待測樣品溶液；
6、（3）以高效液相色譜儀-紫外檢測器對所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液、所述待測樣品溶液進(jìn)樣分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間對大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺組分定性，并測定大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的峰面積；其中：
7、采用高效液相色譜儀對大豆磷脂酰膽堿進(jìn)樣分析的色譜條件包括：采用硅膠柱，以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺為流動相a、正己烷-異丙醇-流動相a為流動相b進(jìn)行等度洗脫，然后用紫外檢測器檢測；
8、采用高效液相色譜儀對磷脂酰乙醇胺進(jìn)樣分析的色譜條件包括：采用氨基鍵合硅膠柱，以甲醇溶液-乙腈為流動相進(jìn)行等度洗脫，然后用紫外檢測器檢測；
9、（4）按步驟（3）的方法測定步驟（1）得到的不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別以標(biāo)準(zhǔn)品溶液中大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺濃度為橫坐標(biāo)，測定得到的標(biāo)準(zhǔn)品大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的峰面積為縱坐標(biāo)，通過線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；
10、（5）按步驟（3）的方法測定步驟（2）得到的待測樣品溶液，將測定得到的待測樣品大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的峰面積分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，分別計算待測樣品溶液中大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的濃度，再分別計算得到待測樣品中大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即實現(xiàn)軟膠囊中大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺含量的測定。
11、上述的測定方法，進(jìn)一步的，在步驟（1）、（2）中，所述溶劑為三氯甲烷-甲醇溶液，其中所含三氯甲烷和甲醇的體積比為1~4∶1。大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺在三氯甲烷中的溶解度顯著大于流動相時，可能會導(dǎo)致前沿峰的出現(xiàn)。使用三氯甲烷-甲醇溶液作為溶劑，減小了大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺在溶劑和流動相的溶解度差異，改善色譜峰的峰形。
12、進(jìn)一步的，在步驟（1）中，配制成不同濃度梯度的大豆磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液和磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法包括如下步驟：分別稱取大豆磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品和磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品，用三氯甲烷-甲醇溶液溶解，配制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，再用所述三氯甲烷-甲醇溶液定量稀釋制成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中含大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的濃度梯度在10μg/ml~200μg/ml（如每1ml中含大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺分別為10μg、20μg、40μg、100μg、200μg）。
13、進(jìn)一步的，在步驟（2）中，所述濾過采用的濾頭為0.45μm尼龍66濾頭。用于去除細(xì)小顆粒物，避免損傷液相儀器和色譜柱。
14、進(jìn)一步的，在步驟（3）中，采用高效液相色譜儀對大豆磷脂酰膽堿進(jìn)樣分析的色譜條件還包括：硅膠柱的規(guī)格為4.6mm×250mm，柱溫為35~45℃，進(jìn)樣量為10~50μl；所述紫外檢測器的波長為205nm。硅膠柱的硅羥基與磷脂酰膽堿的羰基存在極性相互作用，流動相a中的乙胺減少了磷脂酰膽堿峰拖尾。
15、進(jìn)一步的，在步驟（3）中，所述流動相a中，甲醇、水、冰醋酸、三乙胺的體積比為80~90∶10~20∶0.45∶0.05；所述流動相b中，正己烷、異丙醇、流動相a的體積比為17~23∶45~51∶32；所述流動相a和流動相b的體積比為（本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種軟膠囊中大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺含量的測定方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在步驟（1）、（2）中，所述溶劑為三氯甲烷-甲醇溶液，其中所含三氯甲烷和甲醇的體積比為1~4∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定方法，其特征在于，在步驟（1）中，配制成不同濃度梯度的大豆磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液和磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法包括如下步驟：分別稱取大豆磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品和磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品，用三氯甲烷-甲醇溶液溶解，配制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，再用所述三氯甲烷-甲醇溶液定量稀釋制成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中含大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的濃度梯度在10μg/mL~200μg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在步驟（2）中，所述濾過采用的濾頭為0.45μm尼龍66濾頭。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在步驟（3）中，采用高效液相色譜儀對大豆磷脂酰膽堿進(jìn)樣分析的色譜條件還包括：硅膠柱的規(guī)格為4.6mm×250mm，柱溫為35~45℃，進(jìn)樣量為10~50
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在步驟（3）中，所述流動相A中，甲醇、水、冰醋酸、三乙胺的體積比為80~90∶10~20∶0.45∶0.05；所述流動相B中，正己烷、異丙醇、流動相A的體積比為17~23∶45~51∶32；所述流動相A和流動相B的體積比為（30~50）：（70~50），流速為0.5~2mL/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在步驟（3）中，采用高效液相色譜儀對磷脂酰乙醇胺進(jìn)樣分析的色譜條件還包括：氨基鍵合硅膠柱的規(guī)格為4.6mm×250mm，柱溫為35~45℃，進(jìn)樣量為20~100μL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在步驟（3）中，所述甲醇溶液由冰醋酸、三乙胺和甲醇按體積比0.40~0.50∶0.05∶100混合得到；所述甲醇溶液-乙腈中，甲醇溶液和乙腈的體積比為（15~35）∶（85~65），流速為0.5~2mL/min。
9.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在步驟（5）中，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液中大豆磷脂酰膽堿濃度X1為橫坐標(biāo)，磷脂酰膽堿的峰面積Y1為縱坐標(biāo)，線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y1=?4872.287?X1?-4919.591，相關(guān)系數(shù)r1為0.999；以標(biāo)準(zhǔn)品溶液中磷脂酰乙醇胺濃度X2為橫坐標(biāo)，磷脂酰乙醇胺的峰面積Y2為縱坐標(biāo)，線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y2=35111.400?X2?+75330.667，相關(guān)系數(shù)r2為0.999。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的測定方法，其特征在于，在步驟（5）中，待測樣品中大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算公式為M=；其中，M為待測樣品中大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的含量，單位%；c為步驟（5）中計算得到的待測樣品溶液中大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的濃度，單位μg/mL；V為步驟（2）中所制備的待測樣品溶液的總體積，單位mL；m為步驟（2）中所稱取的待測樣品的質(zhì)量，單位mg。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種軟膠囊中大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺含量的測定方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在步驟（1）、（2）中，所述溶劑為三氯甲烷-甲醇溶液，其中所含三氯甲烷和甲醇的體積比為1~4∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定方法，其特征在于，在步驟（1）中，配制成不同濃度梯度的大豆磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液和磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法包括如下步驟：分別稱取大豆磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品和磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品，用三氯甲烷-甲醇溶液溶解，配制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，再用所述三氯甲烷-甲醇溶液定量稀釋制成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，標(biāo)準(zhǔn)品溶液中含大豆磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺的濃度梯度在10μg/ml~200μg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在步驟（2）中，所述濾過采用的濾頭為0.45μm尼龍66濾頭。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在步驟（3）中，采用高效液相色譜儀對大豆磷脂酰膽堿進(jìn)樣分析的色譜條件還包括：硅膠柱的規(guī)格為4.6mm×250mm，柱溫為35~45℃，進(jìn)樣量為10~50μl；所述紫外檢測器的波長為205nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，在步驟（3）中，所述流動相a中，甲醇、水、冰醋酸、三乙胺的體積比為80~90∶10~20∶0.45∶0.05；所述流動相b中，正己烷、異丙醇、流動相a的體積比為17~23∶45~51∶32；所述流動相a和流動相b的體積比為（30~50）：（70~50），流速為0.5~2ml...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉武，柳稚文，蔣勝蘭，肖豫湘，孫毅毅，
申請(專利權(quán))人：湖南醇康醫(yī)藥科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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