【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種口蹄疫假病毒細胞培養系統及其應用。本專利技術屬于生物。
技術介紹
1、口蹄疫病毒(foot-and-mouth?disease?virus，fmdv)是一種具有高度傳染性和經濟破壞性的小rna病毒，病毒粒子無包膜，具有二十面體對稱性，包裹著8.4kb的單鏈正鏈rna基因組，口蹄疫病毒基因組含有一個大的開放閱讀框，編碼八種非結構蛋白和四種結構蛋白：非結構蛋白包括lpro、2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d，主要調節口蹄疫病毒的成熟和復制；結構蛋白vp1、vp2、vp3結合形成衣殼表面結構，vp4形成病毒顆粒的內部結構；結構蛋白vp1位于病毒表面，是病毒吸附、內化、復制的關鍵衣殼蛋白，在病毒對抗宿主免疫系統功能時發揮重要作用，是fmdv重要的抗原位點，也是fmdv變異的關鍵蛋白。此外，fmdv可通過直接或間接途徑迅速傳播[6]，其易感動物包括豬、牛、羊等70余種偶蹄類動物。感染后的動物常表現出明顯的臨床癥狀，如發熱、跛行和唾液分泌異常增多，蹄部出現水皰性病變等，嚴重影響動物的健康與生產性能。鑒于口蹄疫對畜牧業發展的嚴重沖擊，對國際貿易的阻礙以及對公共衛生安全的潛在威脅，世界動物衛生組織(woah)將其列為必報動物疫病之首，我國將其列為一類動物疫病，并實行強制免疫措施。
2、鑒于fmdv對公共衛生及經濟構成的嚴重威脅，fmdv活病毒的研究必須在生物安全三級實驗室(bsl-3)或以上級別實驗室中開展以確保安全標準。在高級別生物安全實驗室，高致病性病毒實驗活動的經濟成本和時間成本都很高昂。目前我國現有的
3、trvlp是指具有轉錄和復制能力的病毒樣顆粒[furuyama,wakako?et?al.“development?of?an?imaging?system?for?visualization?of?ebola?virusglycoprotein?throughout?the?viral?lifecycle.”frontiers?in?microbiologyvol.131026644.3nov.2022,doi:10.3389/fmicb.2022.1026644]，它由一種生物安全二級(bsl-2)細胞培養系統來生產，該系統由兩部分組成[wang,zhongyi?et?al.“a?rapidscreen?for?host-encoded?mirnas?with?inhibitory?effects?against?ebola?virususing?atranscription-and?replication-competent?virus-like?particle?system.”international?journal?of?molecular?sciences?vol.19,5?1488.16may.2018,doi:10.3390/ijms19051488]：含有核衣殼基因或其他關鍵基因缺失的基因組病毒rna(復制子)和表達所缺基因蛋白的生產細胞系。trvlp可以實現原病毒粒子完整的病毒生命周期，并且完全局限于產生的細胞。具體來說，trvlp可在包裝細胞內繁殖和傳代，而在野生型細胞中只能單輪感染，從而實現了一些高致病性病毒的研究工作可進行生物安全降級處理的愿望。trvlp細胞培養系統可用于研究病毒與宿主細胞的相互作用、病毒的細胞嗜性、中和抗體檢測及疫苗評價、特異性受體篩選、病毒進入細胞的機制研究、抗病毒藥物篩選等，對于新出現以及重新出現的病毒來說是一種非常有用的病毒學工具，它們具有安全性和多功能性的特點。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種口蹄疫假病毒細胞培養系統及其應用，該體系是一種生物安全二級(bsl-2)細胞培養系統，可用于生產具有轉錄和復制能力的口蹄疫假病毒。
2、為了達到上述目的，本專利技術采用了以下技術手段：
3、本專利技術的一種口蹄疫假病毒細胞培養系統，所述的細胞培養系統由nluc基因替換了口蹄疫病毒衣殼蛋白p1基因的亞基因組復制子fmdv-nluc和穩定整合fmdvp12a3c基因的bhk-21細胞系組成。
4、其中，優選的，所述的口蹄疫病毒為o型fmdv。
5、其中，優選的，所述的nluc基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
6、其中，優選的，所述的亞基因組復制子fmdv-nluc的核苷酸序列如seq?idno.3所示。
7、進一步的，本專利技術還提出了所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統在生產具有轉錄和復制能力且不具有活病毒的感染性的口蹄疫假病毒中的應用。
8、再進一步的，本專利技術還提出了一種使用所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統生產口蹄疫假病毒的方法，所述的方法包括以下步驟：將所述的nluc基因替換了fmdv衣殼蛋白p1基因的亞基因組復制子轉染進穩定整合fmdv?p12a3c基因的bhk-21細胞系，當細胞出現fmdv的典型病變，將病變細胞凍融三次，收獲fmdv病毒樣顆粒，即為所述的口蹄疫假病毒。
9、再進一步的，本專利技術還提出了一種口蹄疫假病毒，所述的口蹄疫假病毒具有轉錄和復制能力，但不具有活病毒的感染性，所述的口蹄疫假病毒使用所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統生產獲得。
10、再進一步的，本專利技術還提出了所述的口蹄疫假病毒在制備檢測fmdv抗體中的應用。
11、其中，優選的，所述的抗體為抗fmdv中和抗體。
12、相較于現有技術，本專利技術的有益效果是：
13、本專利技術提出了一種口蹄疫假病毒細胞培養系統，還提出了一種在穩定整合fmdvp12a3c基因的bhk-21細胞系中生產fmdv-trvlp的方法，本專利技術以nluc報告基因替換fmdv結構蛋白p1基因，構建含有nluc報告基因的fmdv亞基因組復制子fmdv-nluc。fmdv-trvlps可以在穩定整合fmdv?p12a3c基因的bhk-21細胞系中傳代，但在其他細胞中只能導致單次感染，實現了生物安全降級。該trvlp體系為更好地了解fmdv的生命周期提供了一個獨特的基礎研究應用系統。因此，我們還建立了基于fmdv-trvlps的血清中和實驗，可為中和抗體的檢測提供極大的便利。
14、fmdv-nluc復制子系統的構建，為深入研究fmdv的復制和翻譯機制奠定了基礎，也為口蹄疫病毒假病毒的構建提供了必要條件。具體而言，構建的fmdv-nluc復制子可以用于以下領域的研究：(1)fmdv復制和翻譯調控機制研究，(2)表達nluc的fmdv復制子的進一步改進可作為復制子載體應用于復制子疫苗的研制；(3)用作構建口蹄疫假病毒的口蹄疫復制子本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種口蹄疫假病毒細胞培養系統，其特征在于，所述的細胞培養系統由Nluc基因替換了口蹄疫病毒(Foot-and-mouth?disease?virus，FMDV)衣殼蛋白P1基因的亞基因組復制子FMDV-Nluc和穩定整合FMDV?P12A3C基因的BHK-21細胞系組成。
2.權利要求1或2所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統，其特征在于，所述的口蹄疫病毒為O型口蹄疫病毒。
3.權利要求2所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統，其特征在于，所述的Nluc基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
4.如權利要求1所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統，其特征在于，所述的亞基因組復制子FMDV-Nluc的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
5.權利要求1-4任一項所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統在生產具有轉錄和復制能力且不具有活病毒的感染性的口蹄疫假病毒中的應用。
6.一種使用權利要求1-4任一項所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統生產口蹄疫假病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟：將所述的Nluc基因替換了FMDV衣殼蛋白P1基
7.一種口蹄疫假病毒，其特征在于，所述的口蹄疫假病毒具有轉錄和復制能力，但不具有活病毒的感染性，所述的口蹄疫假病毒使用權利要求1-4任一項所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統生產獲得。
8.權利要求7所述的口蹄疫假病毒在制備檢測抗FMDV抗體中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的抗體為抗FMDV的中和抗體。
...【技術特征摘要】
1.一種口蹄疫假病毒細胞培養系統，其特征在于，所述的細胞培養系統由nluc基因替換了口蹄疫病毒(foot-and-mouth?disease?virus，fmdv)衣殼蛋白p1基因的亞基因組復制子fmdv-nluc和穩定整合fmdv?p12a3c基因的bhk-21細胞系組成。
2.權利要求1或2所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統，其特征在于，所述的口蹄疫病毒為o型口蹄疫病毒。
3.權利要求2所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統，其特征在于，所述的nluc基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
4.如權利要求1所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統，其特征在于，所述的亞基因組復制子fmdv-nluc的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
5.權利要求1-4任一項所述的口蹄疫假病毒細胞培養系統在生產具有轉錄和復制能力且...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫世琪，郭慧琛，周海纖，任玫，吳金恩，譚書楨，張韻，董虎，滕志東，白滿元，周靜靜，穆素雨，
申請(專利權)人：中國農業科學院蘭州獸醫研究所中國動物衛生與流行病學中心蘭州分中心，
類型：發明
國別省市：
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