【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于分離分析領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于硼酸修飾捕獲材料的外泌體富集方法。
技術(shù)介紹
1、外泌體是動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物，也是正常生理和病理狀態(tài)下細(xì)胞間通訊的重要工具。外泌體穩(wěn)定存在于多種體液中，如血液、尿液、唾液和腦脊液等。幾乎所有類型的細(xì)胞都能產(chǎn)生外泌體，其形成過程復(fù)雜，涉及質(zhì)膜連續(xù)內(nèi)陷，形成核內(nèi)體和腔內(nèi)囊泡；隨后，部分含有腔內(nèi)囊泡的成熟多泡體與質(zhì)膜融合，釋放直徑30-150?nm的杯盤狀細(xì)胞外囊泡，為外泌體。在外泌體生物發(fā)生過程中，供體細(xì)胞內(nèi)容物和一些細(xì)胞外成分會(huì)被裝載到外泌體中，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、糖類和代謝物，通過受體-配體相互作用將物質(zhì)和信息傳遞給受體細(xì)胞，從而介導(dǎo)許多生理和病理過程。外泌體攜帶的信息能夠反映出親本細(xì)胞的功能狀態(tài)。作為一種生物標(biāo)志物，外泌體能夠提供豐富、穩(wěn)定、敏感且特異的生物信息，通過分析外泌體中與特定疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)非侵入性檢測(cè)，有助于疾病的早期檢測(cè)和診斷。
2、為了實(shí)現(xiàn)基于外泌體的更準(zhǔn)確和可靠的診斷與治療，高效、高純度分離外泌體至關(guān)重要，可根據(jù)其大小、密度、表面電荷或膜蛋白種類進(jìn)行外泌體分離。外泌體分離策略包括超速離心法、超濾法、免疫親和捕獲法、基于聚合物的沉淀法、尺寸排阻法以及微流控技術(shù)等。超速離心法是使用最廣泛的方法，被視為外泌體分離的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其缺點(diǎn)在于容易產(chǎn)生蛋白質(zhì)聚集和脂蛋白污染問題，得到的外泌體通常純度低，分離效率低，且需要昂貴的設(shè)備，耗時(shí)長(zhǎng)。尺寸排阻法能夠保留外泌體的生物活性，但分離的外泌體含有與其大小相似的雜質(zhì)，且難以擴(kuò)大規(guī)模?；诔瑸V的外泌
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種基于硼酸修飾捕獲材料的外泌體富集方法。所述外泌體富集方法簡(jiǎn)單、高效、快速、成本低，獲得的外泌體形態(tài)完好、純度高，且不影響其生物活性，具有重要的實(shí)用價(jià)值和推廣前景。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：
3、一種基于硼酸修飾捕獲材料的外泌體富集方法，包括以下步驟：將硼酸修飾捕獲材料加入待富集溶液中，用tris-hcl調(diào)節(jié)ph至7.8-8.5，于2-8?℃下溫和震蕩孵育5-60min，離心，收集沉淀；用含有果糖或葡萄糖的pbs緩沖液對(duì)沉淀進(jìn)行輕柔洗滌后，加入洗脫液于2-8?℃下洗脫5-30?min，離心，即得到富含外泌體的上清。
4、進(jìn)一步的，所述硼酸修飾捕獲材料是通過將硼酸基團(tuán)引入到氨基金屬有機(jī)骨架材料、氨基功能化氧化石墨烯或氨基修飾二氧化硅微球表面或結(jié)構(gòu)中形成的經(jīng)過硼酸功能化修飾的材料。
5、進(jìn)一步的，待富集溶液中，所述硼酸修飾捕獲材料的濃度為1-6?mg/ml。
6、進(jìn)一步的，所述待富集溶液為血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或尿液。
7、進(jìn)一步的，所述tris-hcl的ph為8.5-9.0，濃度0.1-1?m；所述pbs緩沖液ph為6.6-7.2，濃度0.01?m；其中，pbs緩沖液中果糖或葡萄糖的濃度為20-100?mm。
8、進(jìn)一步的，用含有果糖或葡萄糖的pbs緩沖液對(duì)沉淀進(jìn)行輕柔洗滌的次數(shù)為三次。
9、進(jìn)一步的，所述硼酸修飾捕獲材料可由如下方法制備而成：
10、將羧基苯硼酸超聲溶解于二甲基亞砜中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽（edc·hcl）和n-羥基丁二酰亞胺（nhs），于室溫下攪拌40?min得到活化的羧基苯硼酸溶液；將氨基功能化材料于120?℃下進(jìn)行活化，超聲分散于二甲基亞砜，得到活化的氨基功能化材料；將活化的氨基功能化材料滴入活化的羧基苯硼酸溶液中，于室溫下攪拌反應(yīng)24?h；離心收集沉淀，依次用二甲基亞砜和乙醇洗滌，并于60?℃下真空干燥，即得硼酸修飾捕獲材料。
11、進(jìn)一步的，所述羧基苯硼酸為4-羧基苯硼酸或3-羧基苯硼酸。
12、進(jìn)一步的，所述氨基功能化材料為氨基金屬有機(jī)骨架材料、氨基功能化氧化石墨烯或氨基修飾二氧化硅微球。
13、進(jìn)一步的，所述氨基功能化材料與羧基苯硼酸的質(zhì)量比為1:2-8。
14、進(jìn)一步的，所述羧基苯硼酸的濃度為2~5?mg/ml；所述羧基苯硼酸與edc·hcl的摩爾比為1:1-10；所述edc·hcl與nhs的摩爾比為1:2-5；所述氨基功能化材料的濃度為0.25~2.5?mg/ml。
15、進(jìn)一步的，所述氨基功能化材料活化時(shí)間≥6?h。
16、本專利技術(shù)的有益效果在于：
17、本專利技術(shù)提供的基于硼酸修飾捕獲材料的外泌體富集方法具有純度高、效率高（富集時(shí)間短）、破損率低的優(yōu)點(diǎn)。其非特異性吸附少，整個(gè)過程條件溫和，對(duì)外泌體損傷小，保留了外泌體的完整形態(tài)和生物學(xué)活性。與超速離心法相比，能提高外泌體富集純度，縮短富集時(shí)間且成本低，解決了傳統(tǒng)方法中普遍存在的成本高、外泌體純度低、耗時(shí)長(zhǎng)和高破損率的問題，可更方便地獲取高質(zhì)量的外泌體，適于推廣和應(yīng)用。
本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于硼酸修飾捕獲材料的外泌體富集方法，其特征在于，包括以下步驟：將硼酸修飾捕獲材料加入待富集溶液中，用Tris-HCl調(diào)節(jié)pH至7.8-8.5，于2-8?℃下溫和震蕩孵育5-60?min，離心，收集沉淀；用含有果糖或葡萄糖的PBS緩沖液對(duì)沉淀進(jìn)行輕柔洗滌后，加入洗脫液于2-8?℃下洗脫5-30?min，離心，即得到富含外泌體的上清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體富集方法，其特征在于，所述硼酸修飾捕獲材料是通過將硼酸基團(tuán)引入到氨基金屬有機(jī)骨架材料、氨基功能化氧化石墨烯或氨基修飾二氧化硅微球表面或結(jié)構(gòu)中形成的經(jīng)過硼酸功能化修飾的材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體富集方法，其特征在于，待富集溶液中，所述硼酸修飾捕獲材料的濃度為1-6?mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體富集方法，其特征在于，所述待富集溶液為血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或尿液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體富集方法，其特征在于，所述Tris-HCl的pH為8.5-9.0，濃度0.1-1?M；所述PBS緩沖液pH為6.6-7.2，濃度0.01?M；其中，PBS緩
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體富集方法，其特征在于，所述硼酸修飾捕獲材料由如下方法制備而成：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的外泌體富集方法，其特征在于，所述羧基苯硼酸為4-羧基苯硼酸或3-羧基苯硼酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的外泌體富集方法，其特征在于，所述氨基功能化材料為氨基金屬有機(jī)骨架材料、氨基功能化氧化石墨烯或氨基修飾二氧化硅微球。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的外泌體富集方法，其特征在于，所述氨基功能化材料與羧基苯硼酸的質(zhì)量比為1:2-8。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的外泌體富集方法，其特征在于，所述羧基苯硼酸的濃度為2~5mg/mL；所述羧基苯硼酸與EDC·HCl的摩爾比為1:1-10；所述EDC·HCl與NHS的摩爾比為1:2-5；所述氨基功能化材料的濃度為0.25~2.5?mg/mL。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于硼酸修飾捕獲材料的外泌體富集方法，其特征在于，包括以下步驟：將硼酸修飾捕獲材料加入待富集溶液中，用tris-hcl調(diào)節(jié)ph至7.8-8.5，于2-8?℃下溫和震蕩孵育5-60?min，離心，收集沉淀；用含有果糖或葡萄糖的pbs緩沖液對(duì)沉淀進(jìn)行輕柔洗滌后，加入洗脫液于2-8?℃下洗脫5-30?min，離心，即得到富含外泌體的上清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體富集方法，其特征在于，所述硼酸修飾捕獲材料是通過將硼酸基團(tuán)引入到氨基金屬有機(jī)骨架材料、氨基功能化氧化石墨烯或氨基修飾二氧化硅微球表面或結(jié)構(gòu)中形成的經(jīng)過硼酸功能化修飾的材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體富集方法，其特征在于，待富集溶液中，所述硼酸修飾捕獲材料的濃度為1-6?mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體富集方法，其特征在于，所述待富集溶液為血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或尿液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體富集方法，其特征在于，所述tris-hcl的ph為8.5-9...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：喬曉強(qiáng)，謝沛涓，王學(xué)麗，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河北大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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