【技術實現步驟摘要】
本申請屬于生物醫藥，尤其涉及一種pdgfra+間充質干細胞及其識別鑒定、分選、培養方法與應用。
技術介紹
1、牙頜疾病與心血管疾病、癌癥被世界衛生組織列為人類“三大非傳染性重點防治疾病”，頜面創傷、腫瘤、感染、先天畸形等常導致牙齒缺損/缺失和頜骨缺損，其發病率高，不僅嚴重破壞口腔頜面部生理功能，也嚴重影響患者的心理和全身健康，顯著降低生存質量。因此，探究牙周組織的有效再生成為口腔醫學領域中的重要課題。
2、牙齒發育過程中，牙胚的形成起源于顱神經嵴細胞，經歷上皮-間充質轉化后，間充質在上皮的誘導下分化形成牙囊和牙乳頭，歷經帽狀期、蕾狀期、鐘狀期逐漸發育分化形成牙髓和牙周組織等牙齒組織。目前，組織工程再生領域中，根據器官發育原理指導組織再生成為關鍵的研究方向。但是，牙齒發育組織的細胞構成具有高度的異質性，不同標記的細胞在功能方面也具有異質性。然而，當前大量研究是在常用的間充質干細胞的基礎上進行組織再生應用，對于牙源性間充質干細胞的定義缺乏特異性，且對于復雜的生理微環境下發育再生機制調控研究缺乏清晰的研究。因此，從牙發育性組織中篩選定義一群牙發育性間充質祖細胞并分離、獲得、持續培養就成為了研究的重點。
3、尤其是，能否探索出一群具有強大牙周再生能力的特定牙源性間充質干細胞群對于改善干細胞在牙周組織再生治療中的效果至關重要，從而為臨床上實現牙周缺損的有效再生提供更加具有潛力的種子細胞。
技術實現思路
1、本申請實施例的目的在于提供一種pdgfra+間充質干細胞及其識
2、本申請實施例是這樣實現的，一種pdgfra+間充質干細胞的識別鑒定方法，包括：
3、制備牙發育性組織的單細胞懸液；所述牙發育性組織包括下頜第三磨牙周圍的牙囊組織、根尖牙乳頭組織；
4、利用含有獨特條形碼的凝膠微珠對所述單細胞懸液進行標記，進一步與油混合形成油包水液滴，經逆轉錄反應產生全長cdna，并使用回收劑破壞乳液，使用磁珠進行cdna清潔，擴增的cdna被進一步修飾后，構建單細胞rna測序文庫；
5、經單細胞轉錄組測序以及生物信息學聯合分析，識別鑒定出共有高表達成牙和成骨發育蛋白基因的pdgfra+間充質干細胞。
6、本申請實施例還提供了一種pdgfra+間充質干細胞的分選方法，包括：
7、制備牙發育性組織的單細胞懸液；所述牙發育性組織包括下頜第三磨牙周圍的牙囊組織、根尖牙乳頭組織；
8、將所述單細胞懸液與生物素標記的cd140a單克隆抗體進行孵育培養，所得細胞與陽性選擇珠結合，經洗滌后，置于磁場中以分選得到pdgfra+間充質干細胞。
9、本申請實施例還提供了一種pdgfra+間充質干細胞，所述pdgfra+間充質干細胞是由上述的pdgfra+間充質干細胞的分選方法分選得到。
10、本申請實施例還提供了一種維持pdgfra+間充質干細胞穩定表達的培養方法，包括：
11、用10％α-mem培養基對上述的pdgfra+間充質干細胞進行培養，直至細胞貼壁后，更換為無血清培養基繼續培養，待細胞融合率達到90％時進行特征基因表達驗證。
12、優選地，將pdgfbb以100ng/ml的濃度補充到所述無血清培養基中。
13、本申請實施例還提供了一種上述的pdgfra+間充質干細胞在制備治療牙周組織缺損藥物中的應用。
14、本申請實施例還提供了一種治療牙周組織缺損的藥物，所述藥物包括上述的pdgfra+間充質干細胞，以及藥學上可接受的輔料和載體。
15、本申請實施例提供了pdgfra+間充質干細胞的識別鑒定方法、分選方法以及維持pdgfra+間充質干細胞穩定表達的培養方法，本申請基于單細胞測序篩選牙發育性間充質干細胞新亞群pdgfra+mscs，并通過標記基因進行體外磁珠分選及細胞亞群驗證，在無血清、pdgfbb處理條件下，獲得具有良好增殖能力、成骨分化能力及促進內皮細胞遷移及成管腔能力的pdgfra+mscs。本申請鑒定篩選出的成體牙發育性間充質干細將為基于人牙頜干細胞的再生轉化應用提供更加充足的種子細胞來源。
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1.一種PDGFRA+間充質干細胞的識別鑒定方法，其特征在于，包括：
2.一種PDGFRA+間充質干細胞的分選方法，其特征在于，包括：
3.根據權利要求2所述的PDGFRA+間充質干細胞的分選方法，其特征在于，所述制備牙發育性組織的單細胞懸液的步驟，包括：
4.根據權利要求2所述的PDGFRA+間充質干細胞的分選方法，其特征在于，所述將所述單細胞懸液利用生物素標記的CD140a單克隆抗體進行孵育培養，所得細胞與陽性選擇珠結合，置于磁場中以分選得到PDGFRA+間充質干細胞的步驟，包括：
5.一種PDGFRA+間充質干細胞，其特征在于，所述PDGFRA+間充質干細胞是由權利要求2-4任一所述的PDGFRA+間充質干細胞的分選方法分選得到。
6.一種維持PDGFRA+間充質干細胞穩定表達的培養方法，其特征在于，包括：
7.根據權利要求6所述的維持PDGFRA+間充質干細胞穩定表達的培養方法，其特征在于，所述無血清培養基為不含FBS的α-MEM培養基；培養條件為：37℃、5％CO2。
8.根據權利要求6
9.一種權利要求5所述的PDGFRA+間充質干細胞在制備治療牙周組織缺損藥物中的應用。
10.一種治療牙周組織缺損的藥物，其特征在于，所述藥物包括權利要求5所述的PDGFRA+間充質干細胞，以及藥學上可接受的輔料和載體。
...【技術特征摘要】
1.一種pdgfra+間充質干細胞的識別鑒定方法，其特征在于，包括：
2.一種pdgfra+間充質干細胞的分選方法，其特征在于，包括：
3.根據權利要求2所述的pdgfra+間充質干細胞的分選方法，其特征在于，所述制備牙發育性組織的單細胞懸液的步驟，包括：
4.根據權利要求2所述的pdgfra+間充質干細胞的分選方法，其特征在于，所述將所述單細胞懸液利用生物素標記的cd140a單克隆抗體進行孵育培養，所得細胞與陽性選擇珠結合，置于磁場中以分選得到pdgfra+間充質干細胞的步驟，包括：
5.一種pdgfra+間充質干細胞，其特征在于，所述pdgfra+間充質干細胞是由權利要求2-4任一所述的pdgfra+間充質干細胞的分選方法分選得...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉佳寧，隋秉東，金鈁，鄭晨曦，肖依寒，
申請(專利權)人：中國人民解放軍空軍軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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